8對手性片段大鬧蛋白組

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來源：美中藥源

2019-03-11

最近化學(xué)生物學(xué)大牛Cravatt發(fā)表了一篇用分子片段在細(xì)胞水平、蛋白組范圍為多個蛋白尋找小分子配體的工作。作者用8對互為對映體的小分子片段作為探針、設(shè)計了16個（8對對映體）所謂完全功能化片段（FFF）。

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最近化學(xué)生物學(xué)大牛Cravatt發(fā)表了一篇用分子片段在細(xì)胞水平、蛋白組范圍為多個蛋白尋找小分子配體的工作。作者用8對互為對映體的小分子片段作為探針、設(shè)計了16個（8對對映體）所謂完全功能化片段（FFF）。這些FFF由三部分組成，除了與蛋白結(jié)合的探針片段外、還有一個在紫外光照下可以與蛋白質(zhì)反應(yīng)的雙***和一個可以與疊氮在生物環(huán)境下高效反應(yīng)的炔基。分子片段與蛋白結(jié)合后增加這些蛋白被雙***降解后形成卡賓捕捉的幾率，被捕捉蛋白再通過點(diǎn)擊反應(yīng)被撈出，然后通過熒光或質(zhì)譜鑒定是哪些蛋白沒能抵制住FFF的誘惑。

作者用這些FFF在PBMC和HEK293兩種細(xì)胞中釣魚，找到176個能與至少一個小分子片段結(jié)合的蛋白。這些找到新配體的蛋白有些有已知的小分子配體，作者證明這些已知配體（通常是活性腔配體）可以與這些片段競爭，說明這些片段并非與功能無關(guān)的結(jié)合腔結(jié)合。因?yàn)檫@些FFF與蛋白形成了共價結(jié)合物，所以分析FFF接在降解后蛋白的哪個多肽上也可以佐證結(jié)合腔。作者只用了8對對映體就為176個蛋白找到心儀配體，如果擴(kuò)大FFF范圍有望為多數(shù)蛋白找到小分子配體、也可以根據(jù)成功率定義某個特定蛋白的成藥性。

藥源解析

這個工作涉及新藥發(fā)現(xiàn)早期階段的幾個重要方面、其FFF設(shè)計和用到的分析技術(shù)也很巧妙，值得解讀一下。靶點(diǎn)的成藥性是新藥發(fā)現(xiàn)立項的一個關(guān)鍵考慮，如果事先知道一個靶點(diǎn)成藥性很差廠家則可以放棄在篩選上的過度投入、避免浪費(fèi)太多時間和資源。當(dāng)然有些與疾病高度相關(guān)、但成藥性差的靶點(diǎn)如KRAS制藥業(yè)明知山有虎偏向虎山行是另一回事，成藥性這個信息還是十分關(guān)鍵的。這個工作如果擴(kuò)展可能在蛋白組范圍為多數(shù)蛋白的成藥性分層。很多蛋白沒有已知小分子配體，為蛋白找到一個可以在細(xì)胞環(huán)境下結(jié)合的先導(dǎo)物是藥物優(yōu)化的第一步。在一定程度上這176個蛋白已經(jīng)有了苗頭化合物。

這個工作的基本思路早就有了，但是細(xì)節(jié)上作者做了重要改進(jìn)。分子片段因?yàn)楸容^小所以與任何蛋白結(jié)合都不會太強(qiáng)、選擇性也不會太好，作者定義的選擇性結(jié)合是兩個對映體捕捉的同一蛋白相差2.5倍以上。之所以比較對映體是因?yàn)榭ㄙe化學(xué)反應(yīng)活性極強(qiáng)、即使探針沒有與蛋白結(jié)合或者非特異結(jié)合也會通過隨機(jī)分子間碰撞捕捉住一些蛋白。而細(xì)胞內(nèi)不同蛋白的表達(dá)量差很多，所以高表達(dá)蛋白按概率也會更多被捕捉。但因?yàn)榈鞍捉Y(jié)合腔通常是手性環(huán)境，所以對映體之間的差別可以作為排除非特異結(jié)合的一個指標(biāo)（如果兩個對映體捕捉同量蛋白說明特異性結(jié)合沒有起到關(guān)鍵作用）。所以通過這個程序捕捉的蛋白并不一定是結(jié)合力最強(qiáng)的蛋白、也不一定是被捕捉量的蛋白，因?yàn)槿绻Y(jié)合腔不能區(qū)分探針手性無論結(jié)合力多強(qiáng)都會被當(dāng)作噪音（對映體之間無差別）被去掉。這是這個工作設(shè)計上的一個重要改進(jìn)。

通常一個靶點(diǎn)要找到有用的小分子配體都得篩選上百萬的化合物庫，他們怎么只用16個片段就篩選了整個蛋白組、并為176個蛋白找到了配體了呢？當(dāng)然原因是探針濃度的慷慨和結(jié)合強(qiáng)度的容忍。探針濃度在20-200 uM之間，而因?yàn)楹Y選的陽性標(biāo)準(zhǔn)是化學(xué)反應(yīng)速率較小的差別（2.5倍）、所以對結(jié)合強(qiáng)度要求可能非常低。另外捕捉蛋白量的不同也可能是對映體結(jié)合力相同但卡賓與蛋白C-H的插入反應(yīng)速率有差別，但作者認(rèn)為這也是個有用信息。即使如此作者只用8對對映體就捕捉了176個蛋白還是很高效，尤其考慮到80%的蛋白只與一個探針結(jié)合，說明結(jié)合有一定選擇性。這些探針都是結(jié)構(gòu)比較相似的氨基取代芳香化合物，是GPCR受體的所謂優(yōu)勢骨架，但這176個蛋白中GPCR并不多。很多與這些化合物結(jié)合的蛋白是酶，但也有一些比較難成藥的蛋白如轉(zhuǎn)錄因子。

除了設(shè)計這個工作中用的一些技術(shù)也很巧妙。多數(shù)能令蛋白C-H鍵參與的化學(xué)反應(yīng)都需要酸堿催化、或高溫、或需要有機(jī)溶劑，在pH7室溫水溶液中能與天然蛋白加成的反應(yīng)半只手就能數(shù)過來。打撈被捕捉蛋白的點(diǎn)擊反應(yīng)知道的人很多，但不一定有很多人理解Sharpless從茫茫人海中找到這個不起眼的古老化學(xué)反應(yīng)需要的功力。從看著就像千里馬的馬中找到千里馬容易，但從長相普通的馬中找到千里馬要看手藝。因?yàn)椴蹲降鞍赘患壤挥袔妆?，所以?zhǔn)確分析很重要。他們把細(xì)胞分成兩份、分別用兩個對映體處理，但其中一份用同位素標(biāo)記的氨基酸培養(yǎng)。分析時把兩份細(xì)胞混合起來做高通量質(zhì)譜、這樣就知道哪個蛋白來自哪份細(xì)胞。同樣也可以用同位素標(biāo)記的甲醛衍生化捕捉蛋白，而另一個更高通量的分析方法準(zhǔn)確性也足夠可靠。

制藥工業(yè)中這個體系更經(jīng)常用于候選藥物在細(xì)胞內(nèi)與靶點(diǎn)的結(jié)合確證。在純化蛋白有活性的化合物需要有在細(xì)胞環(huán)境下與靶點(diǎn)蛋白相互作用的證據(jù)，否則會成為一個開發(fā)風(fēng)險。這個數(shù)據(jù)雖然不一定必須要有，很多上市藥物當(dāng)年沒有這個數(shù)據(jù)。但靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)類似探險的地圖，雖然沒有地圖你也可能找到寶藏并安全返回、但犧牲在路上的風(fēng)險大增。

找到一個能與蛋白結(jié)合的探針只是萬里長征第一步。這樣小的配體要優(yōu)化成可以作為藥物使用的分子需要很長時間，通常需要有蛋白晶體結(jié)構(gòu)的指導(dǎo)、否則難度太大。足夠活性的化合物找到后可能在動物模型中無法重復(fù)基因?qū)W研究結(jié)果、或者**太大。即使一切順利進(jìn)入臨床也只有5-10%的可能上市、有1-2%的可能成為公司可以依賴的大產(chǎn)品。這個工作雖然非常出色，但只相當(dāng)于登山從大本營出發(fā)、與登頂還相隔無數(shù)磨難。藥物發(fā)現(xiàn)就是這么難。

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