一、研究背景
1. 質(zhì)量即生命
由于生物制品通常是直接注射給藥，產(chǎn)品若遭受病毒污染，對患者可能造成重大傷害。在人類歷史上，**和血液制品等都曾出現(xiàn)過病毒污染的案例。
表1 歷史上生物制品病毒污染案例
現(xiàn)代生物制品經(jīng)常使用動物細胞來作為蛋白表達生產(chǎn)系統(tǒng)，以保證產(chǎn)物的正確構(gòu)象和活性，比較常見的一種就是中國倉鼠卵巢細胞系（CHO細胞）。作為嚙齒類動物細胞，CHO細胞常表達內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒，在細胞上清中通?？蓹z測到103～109/mL逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒。這些顆粒形態(tài)、生化性質(zhì)、序列等與傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒相似。
CHO細胞培養(yǎng)過程中有可能發(fā)生外源性病毒污染，各國藥監(jiān)機構(gòu)要求臨床試驗前和生產(chǎn)階段前的申報材料中，純化工藝必須經(jīng)過病毒清除/滅活驗證，以確保無論是臨床試驗患者注射用，還是推向市場的產(chǎn)品，均不會出現(xiàn)病毒污染，釀成重大醫(yī)療事故。
2. 國內(nèi)外病毒清除驗證法律法規(guī)
美國、歐盟法規(guī)建立相對較早，體系相對健全；國內(nèi)法規(guī)發(fā)布較晚，主要在參照美國、歐盟法規(guī)的基礎(chǔ)上，結(jié)合自身實際，做了一定的完善。
隨著國外申報或中外雙報的生物制品企業(yè)越來越多，本文整理了關(guān)于國內(nèi)外病毒清除驗證法律法規(guī)及遵循的指導(dǎo)原則，見表2。
表2 國內(nèi)外病毒清除驗證法律法規(guī)
二、病毒清除驗證常用指示病毒
病毒清除/滅活驗證中，最好的情況是把每種可能出現(xiàn)的污染病毒都做一次驗證，研究數(shù)據(jù)越多、覆蓋面越廣、報告說服力越強，但考慮時間、人力和資金的成本，每種病毒都做一遍，不太現(xiàn)實。
結(jié)合已有的科學(xué)研究，美國、歐盟等藥監(jiān)機構(gòu)官員及病毒學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家提出了指示病毒的概念，即建議在病毒清除驗證過程中采用的病毒包含以下四種特性即可：“單鏈和雙鏈的RNA及DNA、脂包膜和非脂包膜、強和弱抵抗力、大和小顆粒等”。
具體來看，在IND階段，主要以逆轉(zhuǎn)錄病毒、細小病毒和皰疹病毒的清除能力作為抗體或者融合蛋白的病毒清除驗證指標。在NDA和BLA階段，主要使用3～5種指示病毒，呼腸孤病毒、小核糖核酸病毒、多瘤病毒等其他種類病毒的比例會有所增加。
表3 四種常用指示病**質(zhì)
三、國內(nèi)外病毒清除驗證申報差異
1. 指示病毒的差異
國內(nèi)指導(dǎo)原則要求比較詳細具體，明確指出了病毒類型；國外規(guī)則沒有寫明病毒具體要求，僅要求盡可能選擇污染產(chǎn)品最相似的病毒進行驗證，即特異性指示病毒；同時需要關(guān)注理化性質(zhì)較寬的非特異性病毒。
2. 工藝選擇上的差異
國內(nèi)IND申報時，一般選擇低pH和膜過濾這兩個工藝進行驗證；國外申報時，除了選擇低pH和膜過濾，還需進行層析工藝驗證。
3. 在工藝重復(fù)性方面的差異
國內(nèi)指導(dǎo)原則雖然沒有硬性規(guī)定，但通常需要做三個批次；在國外的指導(dǎo)原則中，明確指出至少分別做兩次獨立的研究來證實清除的可重復(fù)性，因此一般是一批樣品重復(fù)2次。
表4 國內(nèi)外病毒清除驗證工藝流程對比
四、我國病毒清除/滅活驗證技術(shù)服務(wù)機構(gòu)
目前，進行病毒清除驗證研究有三種方式：企業(yè)自驗證、第三方驗證、中檢院驗證（中國食品藥品檢定研究院）。限于建設(shè)生物安全二級實驗室的高昂成本，以及在構(gòu)建符合國內(nèi)外申報標準的病毒清除/滅活驗證體系方面的困難，比如獲得相應(yīng)的指示病毒株，為控制成本考慮，大多數(shù)生物制藥企業(yè)主要提交中檢院或者第三方機構(gòu)開展病毒清除滅活驗證。
近年來，單克隆抗體和重組蛋白類等生物制品研發(fā)熱火朝天，在眾多生物制藥企業(yè)的迫切需求之下，第三方技術(shù)服務(wù)機構(gòu)逐漸增多，并逐步接軌國際標準。目前，國內(nèi)第三方檢測機構(gòu)有蘇州藥明康德檢測檢驗、中科世生、義翹神州、蘇州良辰、武漢珈創(chuàng)、南京鐘鼎等。
表5 國內(nèi)病毒清除/滅活驗證技術(shù)第三方機構(gòu)簡介
以年均開展病毒清除業(yè)務(wù)批次為統(tǒng)計指標進行分析，南京鐘鼎和藥明檢測在第三方服務(wù)市場中各占三分之一，北京義翹神州則排在第三位（占19%）。從地域分布上，第三方驗證機構(gòu)主要分布在北京和長三角等地區(qū)，華南和西部地區(qū)還是一片空白。
圖 六家服務(wù)企業(yè)在第三方病毒清除驗證市場份額
五、小結(jié)
目前生物制品病毒清除/滅活驗證機構(gòu)屈指可數(shù)，有些機構(gòu)驗證使用的方法或采用的指示病毒不同，其報告并不被國外評審機構(gòu)認可，而申報國外的話，有時只能轉(zhuǎn)戰(zhàn)國外機構(gòu)。由此可見，我國病毒清除驗證領(lǐng)域還需深耕，亟待借鑒國際先進理念和經(jīng)驗，科學(xué)開展研究等提高行業(yè)實力。
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