近日，華人抗體協(xié)會旗下期刊、牛津大學出版社出版的Antibody Therapeutics發(fā)表了一篇原文標題為“Biology drives the discovery of bispecific antibodies as innovative therapeutics”[1]的綜述論文。該論文的英文全文可通過如下鏈接來免費獲得：https://academic.oup.com/abt/article/3/1/18/5739255

       第一作者和共同通訊作者為藥明生物（WuXi Biologics）的聶思惟博士，資深共同通訊作者為藥明生物執(zhí)行副總裁、首席科學官顧繼杰博士，顧博士同時也是mAbs和Antibody Therapeutics的編委，此前他曾在雅培和艾伯維長期從事抗體工程和靶點生物學方面的抗體藥物研發(fā)工作。除了文中列出的其他來自藥明生物的作者之外，此文還有三位作者來自科睿唯安（Clarivate Analytics），作者借助于科睿唯安的Cortellis數(shù)據(jù)庫，使此文中的數(shù)據(jù)更加詳實可靠。本文意在對這篇綜述進行簡要介紹。

       論文摘要和亮點

       雙特異性抗體（Bispecific Antibody本文以下簡稱雙抗），是指一個抗體分子可以與兩個不同抗原或者與同一抗原的兩個不同抗原表位相結合。雙抗的概念已經提出一個甲子整整六十年了，理想的雙抗在臨床前研究和臨床治療上比混合使用兩個單抗更有優(yōu)勢，是因為其具有區(qū)別于單抗的獨特生物學機理，為研發(fā)新型治療方法提供了更多路徑。隨著業(yè)界對各種天然或者人工合成的雙抗的結構、生物合成的研究不斷深入，雙抗在過去十年迎來了巨大的發(fā)展，也取得了可觀的成就。截止2019年9月，超過110種雙抗處于臨床開發(fā)階段，接近180種處于臨床前開發(fā)階段。

       目前雙抗研究如雨后春筍不斷涌現(xiàn)，本文作者借助于科睿唯安的Cortellis數(shù)據(jù)庫，首次系統(tǒng)性地對目前處于臨床前和臨床階段的抗體進行分類，將現(xiàn)有雙抗進展全面、直觀地呈現(xiàn)給讀者。根據(jù)抗原結合域以及是否包含F(xiàn)c片段，作者把雙抗格式分為30個主要類別，并詳細介紹了目前處于臨床前和臨床階段大約290種雙抗的生物學作用機制。作者期望通過闡述三個原則，即生物學機理驅動，雙抗格式（format）匹配，以及用六個要素指導來正確地選擇進入臨床階段的雙抗候選分子，來解決臨床治療需求。目前各種新型雙抗模式不斷涌現(xiàn)，作用機制也非常新穎，與此同時這些雙抗?jié)撛诘陌踩L險以及風險/收益比應該在臨床前和臨床階段得到評估。盡管如此，作者仍然樂觀預測，未來十年將看到一些具有全新作用機理的雙抗或者多抗在臨床上的成功表現(xiàn)，并且預測我們將見證下一個抗體藥開發(fā)高速發(fā)展的新浪潮。

       這篇綜述論文主要包括如下幾個方面：

       1、抗體發(fā)展史

       2、雙抗設計的原則

       3、雙抗格式分類

       4、雙抗研發(fā)和市場現(xiàn)狀的分析

       5、雙抗分子的生物學機理及其臨床應用分類

       6、選擇最優(yōu)格式來實現(xiàn)雙抗分子的生物學機理

       7、根據(jù)六個要素來優(yōu)化及確定最終的雙抗候選藥物分子

       8、目前雙抗臨床上仍然存在的挑戰(zhàn)

       9、最后展望未來雙抗或者多抗的發(fā)展

       一、抗體發(fā)展史

       首先，作者簡單回顧了單克隆抗體的發(fā)展史：1975年雜交瘤技術出現(xiàn)，使得單克隆抗體發(fā)展進入新世紀。然而，由于免疫原性等原因，在1975 – 1986年之間大部分單抗的研發(fā)都以失敗而告終，只有一個針對CD3的鼠源單克隆抗體Muromonab（商品名為Orthoclone OKT3）獲批。在前期失敗的經驗基礎上，又是一個十年過去了。為了解決免疫原性的問題，嵌合抗體、人源化抗體以及全人抗體等新技術應運而生。1997年，美國FDA批準利妥昔單克隆抗體（Rituximab）上市，標志著抗體研發(fā)進入一個爆發(fā)的新世紀。至今約23年以來，全球大約100種抗體類藥物獲批上市，抗體藥物儼然成為了當前最受矚目的新療法以及各大藥廠研究的新寵和焦點。

       類似于單克隆抗體的發(fā)展進程，雙抗的研發(fā)歷史也經歷了類似的發(fā)展—困境—突破的過程。其詳細發(fā)展史可參考2019年Nature Reviews Drug Discovery發(fā)表的綜述論文[2]。從上個世紀60年代，科學家們首次嘗試從多克隆抗體血清中分離出兩個Fab片段，并在體外重新組裝成雙特異的F(ab‘)2分子開始，經過了20多年的努力，F(xiàn)ab、Fv、scFv、VHH等結構的特異性終于逐步被研究清楚，從而突破了一直阻礙雙抗開發(fā)的免疫原性、穩(wěn)定性、溶解性，生物學機理以及工業(yè)化生產等困境。在2014年，Blincyto臨床獲批標志著雙抗用于實現(xiàn)全新治療概念的廣闊前景在臨床得到了驗證，這極大地激勵了制藥工業(yè)界對雙抗研發(fā)的熱情。

       二、抗體設計的原則

       基于抗體研發(fā)的困難，作者首次提出如何設計鑒別有潛力的新型雙抗或者多抗的三個原則和六個要素（圖1-A）：

       1. Driven by biology：雙抗分子結構設計應該由生物學機理驅動，雙抗的設計應以能實現(xiàn)其預期的生物學功能為前提，并兼顧有效性和安全性。

       2. Match biology with an optimal format：雙抗的格式應該和生物學機理匹配，這和上述第一點是一致的，不能只是為了不同而設計出新型雙抗。

       3. Select a right molecule：選擇一個可以進入臨床研究的理想雙抗分子需要滿足六個要素，即：a) Efficacy-理想的臨床療效；b) Safety-合適的安全性；c) PK/PD-合理的藥代動力學；d) Physicochemical-合理的理化特性；e) Manufacturability-生產性，即易于臨床和商業(yè)化生產；f) Immunogenicity-盡可能小的免疫原性（參見圖1A & 1B）。

圖1： 圖1A: 雙抗開發(fā)的三大原則； 圖1B: 選擇合適雙抗分子的六個要素

       然而，目前很多抗體在研發(fā)階段并未完全遵從或忽視了三個原則和六個要素，挑戰(zhàn)之處是與生物功能相關的指標（如有效性、安全性、PK/PD和免疫原性）和可開發(fā)性指標（如表達水平、可溶性、穩(wěn)定性、粘度等）往往并不完全相關，有時甚至相互矛盾。因此，如何選擇一個理想的雙抗分子需要全局考量，這對后期臨床開發(fā)的成功至關重要，需在早期發(fā)現(xiàn)和開發(fā)階段被給予更多重視。

       三、抗體分類

       作者將290種目前處于臨床前期和臨床階段的雙抗和多種抗體，采用兩種分類方式：第一，根據(jù)結構分類；第二，根據(jù)功能分類。

       1. 結構分類（參見圖2）

       對于形式繁多的雙抗分子，作者將由五大類抗原結合域（SDA，F(xiàn)v，ScFv，F(xiàn)ab，ScFab）組成的雙抗分子根據(jù)其是否含有Fc片段一共分為30類（如圖2所示），并根據(jù)該分類節(jié)選部分抗體展現(xiàn)給讀者。

       下面5種類型抗體片段是構建雙抗分子最為重要的模塊，即：

       1）SDA（single domain antibody）：單域抗體，也稱為VHH，是指只含有抗體重鏈可變區(qū)結構；

       2）Fv：包含兩個肽鏈，重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL；

       3）ScFv：同樣包含重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL，但是通過linker的形式將VH和VL鏈接在一起成為單一肽鏈；

       4）Fab：含有兩個肽鏈，一個是重鏈可變區(qū)VH和恒定區(qū)CH，另一個含有輕鏈可變區(qū)VL和恒定區(qū)CL；

       5）ScFab：通過linker將Fab的兩個肽鏈連接起來。

       作者認為，雙抗分子形式上的多樣性是由其功能和應用上的不同需求所決定的。根據(jù)不同的目的分子畫像(Target Product Profile, TPP)，雙抗分子的大小、結構域的組合、與抗原結合的親和力和價位、以及其結構上的靈活性等因素都需要仔細的選擇和小心的設計。

圖2，30類雙特異抗體分類及舉例

       2. 功能分類（英文原文表1-6）

       2014年，安進（Amgen）研發(fā)的用于治療急性白細胞血癥Blincyto獲批上市，正式標志著雙抗在臨床上的應用成功獲得驗證。 但是直到三年后，另一款雙抗——由羅氏旗下的基因泰克（Genentech)開發(fā)的Hemlibra才被美國FDA批準用于治療血友病。目前絕大多數(shù)雙抗仍處于臨床早期研究階段（67%處于臨床I期，25%處于臨床II期），只有5個雙抗進入臨床III期。在目前處于臨床階段的雙抗中，約有84%用于治療癌癥。有部分雙抗正在被開發(fā)用于治療自身免疫系統(tǒng)疾病。目前擁有最多處于臨床開發(fā)階段雙抗的公司是安進，其次是MacroGenics、禮來、強生旗下的Janssen、羅氏、賽諾菲以及Xencor。接近一半的雙抗是通過CD3激活T細胞或者通過CD16激活NK細胞殺傷腫瘤細胞；另外一個普遍的策略是特異性地限制雙抗僅在腫瘤環(huán)境中產生效果，從而降低對正常細胞或者組織的損傷。許多公司都擁有其獨特的雙抗技術平臺，例如安進的BiTE、MacroGenics的DART、和羅氏的CrossMab平臺。

       隨著雙抗和多抗技術平臺涌現(xiàn)，在過去3年中，處于臨床階段的雙抗交易（不包括公司兼并收購）數(shù)量增長了140%，達到68億美元的總交易額。其中，38億美元集中在腫瘤領域，10億美元針對感染性疾病領域。

       2018年全球雙抗總銷售額為4.6億美元，主要被安進Blincyto（2.3億美元）和羅氏Hemlibra（2.29億美元）占據(jù)。據(jù)預測，至2024年，Hembira的銷售額會快速增長到39.6億美元，而Blincyto的增速則會略緩和。隨著Hemlibra銷售劇增以及潛在的新型雙抗或者多抗獲批，雙抗或者多抗市場2024年會飆升到54.3億美元。

       本文作者利用Cortellis數(shù)據(jù)庫分析了截止2019年9月所有處于臨床前或臨床階段的雙抗，176種雙抗或者多抗處于臨床前期研究，119種處于臨床階段（包括從IND申請至臨床III期，以及2個研究處于暫停階段），作者采用非常直觀的網絡關系圖將290種抗體匯總于下圖3（即英文原文圖6），涉及的靶點關系一目了然。

       圖3

       作者根據(jù)雙抗或雙功能蛋白的治療領域將其分為抗腫瘤、針對自身免疫系統(tǒng)疾病、以及針對其他疾病的三大類。

       2.1 抗腫瘤雙抗

       根據(jù)Cortellis數(shù)據(jù)庫分析，目前雙抗管線以抗腫瘤產品居多，在119種處于臨床階段和176種處于臨床前的雙抗項目中，分別有99個和153個項目是針對腫瘤領域。作者根據(jù)生物學機理將抗腫瘤雙抗項目進一步分為以下五類：

       2.1.1）抗血管生成（Anti-angiogenesis)：血管生成促進腫瘤的生長，促進其惡化、擴散和轉移，抗血管生成在抗腫瘤中的作用已經被廣泛應用。雙抗分子能同時阻斷兩個，甚至多個血管生成的通路，例如VEGF、VEGFR2、DLL4以及ANGPT2，來增強抗血管生成的效果（英文原文表1）。

       2.1.2）抗腫瘤生成（Anti-tumorigenesis）：靶向致癌受體也是被廣泛使用的抗腫瘤手段之一。在這類雙抗項目中，大部分靶點為HER2、HER3、EGFR、cMet、以及LRP5/6等（英文原文表1）。

       2.1.3）增強抗腫瘤免疫（Enhancing tumor immunity）：腫瘤免疫治療旨在提高病人自身抗腫瘤免疫反應，這主要可以通過增強T 細胞輔助激活信號（即“踩油門”），例如4-1BB、OX40等；或阻斷T細胞反應抑制信號（即“松剎車”），例如臨床上取得巨大成就的抗CTLA4和抗PD1/PD-L1治療。雖然如此，也只有10-30%的病人能受益于PD-1/CTLA4抗體治療。通過同時阻斷兩個不同的T細胞反應抑制信號，雙抗項目能進一步提高“松剎車”的效果。相較于“松剎車”，“踩油門”的腫瘤免疫治療開發(fā)由于其安全性或療效等問題一直沒有突破性的進展。雙抗分子可以通過其巧妙的設計，達到在局部腫瘤部位特異性地激活免疫共刺激信號，從而在提高病人抗腫瘤免疫反應的同時降低這類治療中伴隨的副作用。目前臨床前和臨床期分別有10種和19種這類雙抗分子在研（英文原文表2）。

       2.1.4）調節(jié)腫瘤微環(huán)境（Modulating tumor microenvironment (TME))：為了逃逸免疫系統(tǒng)監(jiān)控，腫瘤可以通過表達免疫抑制分子（如TGFβ、CD73）和招募免疫抑制細胞，來抑制腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞的功能和增殖。有部分雙抗和雙功能蛋白被開發(fā)用于克服腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制作用（英文原文表3）。

       2.1.5）靶向腫瘤細胞的清除（Depletion of target cells）：這個類型體現(xiàn)了目前絕大多數(shù)在研雙抗的生物學機制，即通過介導效應細胞或者通過Fc介導的ADCC、ADCP以及CDC等功能，直接靶向腫瘤細胞達到清除的目的（英文原文表4）。

       2.2 抗炎雙抗

       自身免疫系統(tǒng)疾病是雙抗第二大應用領域，目前分別有10個及12個雙抗項目處于臨床及臨床前階段。這些雙抗項目大部分都是通過同時中和多個促炎因子的功能來達到比單抗更好的抑制炎癥反應的功效。在研的這類雙抗有：IL-1α x IL-1β、IL-17 x IL-13、IL-4 x IL-13和BAFF x IL-17等（英文原文表5）。

       2.3 用于治療其他疾病的雙抗

       例如血友病、眼部疾病、神經疾病、感染性疾病和糖尿病等領域均有雙抗或雙功能蛋白在進行研究和開發(fā)（詳情請參考英文原文表6）。

       四、如何構建雙抗或者多抗實現(xiàn)其特殊生物學特性

       雙抗不同的結構形式可以賦予雙抗分子不同的生物學活性，作者通過討論以下五個構建雙抗的因素來闡述這些因素對雙抗功能的影響：

       1. 抗原-抗體親和力和抗體效價：

       1.1. 親和力：通?？乖?抗體間的特異性結合具有較強的親和力，然而在構建雙抗時，并不是親和力越強越好，而是要因“Target”而異。對于那些以依靠表面受體聚集從而被激活的受體，fast-on、fast-off結合動力學更適合于受體的招募；相反，如果是配體和受體相結合導致受體構象變化的激活，那么slow off結合動力學更適合受體的持久變構和下游信號通路的激活，從而提高生物學功能。

       1.2. 抗體價位：抗體價位的設計對實現(xiàn)雙抗的功能至關重要。比如，T cell engager為了實現(xiàn)嚴格的腫瘤依賴性的T細胞激活，一般這類雙抗分子都會采用單價的CD3 結合方式；然而，靶向腫瘤細胞表面分子（TAA）的抗體價數(shù)則需要根據(jù)該TAA的特性來決定，例如其腫瘤特異性、胞外端的大小和構象、在腫瘤和正常細胞表達上的差異，以及機體對最大化殺死陽性細胞的耐受性。

       2. 抗原結合表位、幾何結構

       2.1.  抗原結合表位：雙抗所需要實現(xiàn)的功能不同，所選的抗原結合表位也不相同。例如拮抗型雙抗需要阻斷某個信號通路，那么只要該雙抗能結合在阻止下游信號激活的結合表位，例如阻斷配體和受體的結合，或是阻斷受體共聚集至免疫突觸中去（例如PD-1），就都能有效地阻斷信號通路的激活，從而發(fā)揮治療效果；

       2.2. 幾何結構（Geometry）：這個因素在T cell engager中有更為突出的體現(xiàn)。為了實現(xiàn)T細胞的激活，需要將T細胞和靶向細胞拉到一個特定距離（~14 nM），形成免疫突觸，從而引起T細胞的激活，減少非特異性細胞殺傷，那么抗體表位和靶向細胞之間的距離以及兩個不同抗原之間的距離就非常重要。同時雙抗的大小可能直接影響其是否能有效地在T細胞和腫瘤細胞間形成免疫突觸，因而此因素可以被巧妙地用于調節(jié)治療窗口。

       3. 連接子（Linker）的設計：用來連接兩個不同抗體的連接子長度、靈活性、氨基酸組成以及連接IgG區(qū)的鉸鏈區(qū)對有效構建雙抗都很重要。

       4. 抗體大?。?/strong>雙抗在血液瘤治療中已經取得了可觀的成就，然而在實體瘤中還需更多研究，其中一個難點就在于如何讓雙抗能更有效的進入腫瘤并發(fā)揮作用。相較于分子量大的雙抗，分子量小的雙抗更容易通過血管滲出快速進入實體瘤，然而其在血液中的半衰期非常短，因此能進入實體瘤的分子數(shù)也相應減少，從而限制了其在實體瘤中的應用。