藥物發(fā)現(xiàn)既昂貴又耗時(shí)。盡管在研發(fā)方面投入了大量資金，但自20世紀(jì)90年代以來(lái)，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的平均藥物數(shù)量一直在下降。目前，每個(gè)被批準(zhǔn)的新分子實(shí)體的研發(fā)成本約為18億美元，再加上專利到期，使制藥公司面臨著艱巨的任務(wù)——開(kāi)發(fā)更多的產(chǎn)品以維持其創(chuàng)新。此外，藥物發(fā)現(xiàn)失敗率的升高會(huì)降低對(duì)衍生化合物、微小配方變化或藥物組合的原創(chuàng)研究熱情。

       決定藥物發(fā)現(xiàn)成功的重要因素之一是體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)。這是指藥物與其靶點(diǎn)的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，包括結(jié)合和解離時(shí)間，這會(huì)影響藥物在體內(nèi)的停留時(shí)間。隨著制藥公司更多地關(guān)注于優(yōu)化靶點(diǎn)結(jié)合親和力和選擇性，藥物動(dòng)力學(xué)往往不被重視，盡管越來(lái)越多的證據(jù)表明動(dòng)力學(xué)參數(shù)與藥物療效的相關(guān)性可能比親和力參數(shù)更強(qiáng)。在此，本文將討論用于研究藥物動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)和建模方法，以及如何利用它們來(lái)提高藥物發(fā)現(xiàn)的成功率。

       01 動(dòng)力學(xué)的重要性

       藥物發(fā)現(xiàn)通常是通過(guò)在恒定藥物濃度下通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)來(lái)識(shí)別和優(yōu)化先導(dǎo)化合物。這些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生均衡量化指標(biāo)，包括半數(shù)抑制濃度（IC50）和平衡解離常數(shù)（KD），用于預(yù)測(cè)藥物活性。

       然而，當(dāng)藥物進(jìn)入人體時(shí)，由于胃腸道吸收、腎 臟排泄和代謝等生理過(guò)程，它們的濃度會(huì)不斷變化。因此，越來(lái)越多的人認(rèn)識(shí)到，基于均衡（equilibrium）的模型來(lái)評(píng)估藥物-靶點(diǎn)相互作用，對(duì)體內(nèi)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)性較差，而能夠捕捉藥物動(dòng)力學(xué)的模型更適用于描述體內(nèi)非均衡情況下的動(dòng)態(tài)藥物-靶點(diǎn)相互作用。

       02 結(jié)合及解離速率

       表征動(dòng)態(tài)藥物相互作用的2個(gè)最基本的單位是結(jié)合速率常數(shù)（association rate constant/on-rate，kon）和解離速率常數(shù)（dissociation rate constant/off-rate，koff）。當(dāng)一起使用時(shí)，這些參數(shù)可以洞察藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物的分子識(shí)別和穩(wěn)定性。研究表明，藥物停留時(shí)間（RT=1/koff是藥物療效和選擇性的關(guān)鍵預(yù)測(cè)因子，因?yàn)橥Ａ魰r(shí)間較長(zhǎng)的藥物能夠通過(guò)減少靶點(diǎn)占有率的下降而產(chǎn)生更持久的作用，靶點(diǎn)占有率用于描述配體分子對(duì)靶點(diǎn)占據(jù)的程度。

       雖然關(guān)于koff和如何減少koff的研究已經(jīng)很多，但關(guān)于koff及其對(duì)體內(nèi)靶點(diǎn)占有率的影響的數(shù)據(jù)相對(duì)較少。有趣的是，Zhou與其同事們（doi:10.1002/psp4.12035）發(fā)現(xiàn)，與流行的觀念相反，增加kon可以延長(zhǎng)靶點(diǎn)占有時(shí)間。這一發(fā)現(xiàn)表明了優(yōu)化kon和koff的重要性。

       IJzerman和Guo認(rèn)為，對(duì)kon的研究不那么重視的一個(gè)原因是對(duì)度量的普遍假設(shè)存在疑問(wèn)。20世紀(jì)90年代初，Smoluchowski開(kāi)發(fā)了一種數(shù)學(xué)方法來(lái)建模生物分子反應(yīng)，例如受體和配體之間的分子反應(yīng)。該模型適用于各向同性、非相互作用的球體，其中kon僅取決于分子的大小及其溶劑的粘度，即擴(kuò)散受限。然而，當(dāng)涉及到具有立體特異性的藥物-靶點(diǎn)相互作用的建模時(shí)，假設(shè)kon不變且擴(kuò)散受限就不再有用了。例如，如果一個(gè)配體只能在特定的位置和方向上與其受體結(jié)合，kon就會(huì)顯著下降。另一方面，有利的靜電吸引可以顯著增加kon。

       03 實(shí)驗(yàn)工具

       據(jù)了解，有多種技術(shù)可以測(cè)量kon和koff，最古老的方法之一是放射配體結(jié)合分析法，但它存在一些局限性，例如難以將**標(biāo)記配體與游離配體分離。這種分析法也忽略了由于配體結(jié)合而在受體中可能發(fā)生的構(gòu)象變化，G蛋白偶聯(lián)受體就是這樣一個(gè)例子。

       一種流行的、無(wú)標(biāo)記的方法是表面等離子體共振（SPR），其中藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物的形成會(huì)導(dǎo)致偏振光的折射率變化。它的優(yōu)點(diǎn)是試劑和樣品消耗量低，不需要標(biāo)記，可以實(shí)時(shí)提供數(shù)據(jù)。SPR可用于測(cè)量各種分子之間的生物分子相互作用，包括蛋白質(zhì)、離子和片段。然而，由于配體是分批測(cè)量的，通量仍然很低。此外，研究膜結(jié)合蛋白可能是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)槠x天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)可能與其靶點(diǎn)具有不同的相互作用。此外，蛋白質(zhì)需要穩(wěn)定地結(jié)合到等離子體芯片上，這可能會(huì)限制這種方法的適用性。

       可以說(shuō)，目前使用最廣泛的技術(shù)是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET），因?yàn)樗鼈兙哂懈哽`敏度、與活細(xì)胞狀態(tài)的相容性，并且能夠通過(guò)商業(yè)設(shè)計(jì)熒光探針用于多種蛋白質(zhì)。

       這2種方法的機(jī)理相似，依賴于能量從供體分子到受體分子的距離依賴性轉(zhuǎn)移。為了使FRET和BRET能夠很好地工作，供體和受體分子必須非常接近（分別為10–100Å和10nm）。在FRET中，分子之間也必須有光譜重疊。與FRET不同，BRET不需要外部光源來(lái)激發(fā)供體分子。因此，它具有非常低的干擾背景信號(hào)，例如與FRET相關(guān)的自發(fā)熒光、光散射和光漂白。

       其他新興的方法包括石英晶體微天平，它可以檢測(cè)由于配體與細(xì)胞結(jié)合而引起的質(zhì)量變化，以及熒光相關(guān)光譜術(shù)，它可以測(cè)量粒子熒光強(qiáng)度的波動(dòng)，其中自由配體可以與緩慢擴(kuò)散的受體結(jié)合配體區(qū)分開(kāi)來(lái)，而無(wú)需物理分離。等溫滴定量熱法（ICT）可實(shí)時(shí)測(cè)量生化反應(yīng)引起的熱變化，并可直接讀出酶活性對(duì)抑制劑結(jié)合的響應(yīng)。例如，熱信號(hào)的變化速率與抑制劑與酶的結(jié)合速率相關(guān)，這使我們能夠計(jì)算結(jié)合速率常數(shù)。雖然ICT在藥物動(dòng)力學(xué)方面的應(yīng)用受到限制（大部分應(yīng)用是在熱力學(xué)方面），但該技術(shù)已被用于確定共價(jià)和非共價(jià)抑制劑與脯氨酰寡肽酶（POP）的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)，后者是治療癌癥和神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。

       對(duì)藥物動(dòng)力學(xué)的日益重視導(dǎo)致了由歐洲創(chuàng)新藥物計(jì)劃（Innovative Medicines Initiative，IMI）與大型制藥公司共同資助的K4DD（Kinetics for Drug Discovery，藥物發(fā)現(xiàn)動(dòng)力學(xué)）項(xiàng)目的誕生。該項(xiàng)目的一個(gè)主要發(fā)現(xiàn)是結(jié)合和解離速率常數(shù)受配體結(jié)構(gòu)的強(qiáng)烈影響。讀者可以參考ChEMBl數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）了解生物活性化合物的結(jié)構(gòu)=動(dòng)力學(xué)關(guān)系。

       04 計(jì)算建模工具

       隨著X射線晶體學(xué)和電子顯微鏡的進(jìn)步，對(duì)藥物-靶點(diǎn)相互作用動(dòng)力學(xué)的分子理解有所提高。利用所得數(shù)據(jù)，研究人員開(kāi)發(fā)了計(jì)算模型，以了解定量結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)關(guān)系（QSKR）。這些模型通常使用統(tǒng)計(jì)機(jī)器學(xué)習(xí)來(lái)獲得藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息或者使用增強(qiáng)采樣的分子動(dòng)力學(xué)模擬來(lái)建立。研究人員還將人工智能與分子模擬相結(jié)合，例如，Ribeiro等人利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)從無(wú)偏分子動(dòng)力學(xué)中學(xué)習(xí)，然后創(chuàng)建了一個(gè)新框架來(lái)研究苯與溶菌酶的解離，這是一種十分受歡迎的常被研究的配體-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

       例如，苯的離解會(huì)在溶菌酶中形成一個(gè)空腔，從而影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)，如變性溫度和與特定配體的結(jié)合。這為優(yōu)化蛋白質(zhì)工程創(chuàng)造了機(jī)會(huì)。Decherchi和Cavalli寫了一篇綜述，總結(jié)了分子模擬和取樣方法的進(jìn)展。在他們的工作中，他們解釋稱，由于配體-蛋白質(zhì)結(jié)合和解除結(jié)合的時(shí)間尺度范圍很廣，因此分子模擬捕捉大分子的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)仍然具有挑戰(zhàn)性?？紤]到分子模擬中的時(shí)間步長(zhǎng)為1飛秒，為了驗(yàn)證毫秒或秒級(jí)的采樣事件，需要1012或1015個(gè)整合步驟，這超出了當(dāng)前可用的計(jì)算技術(shù)。然后，作者總結(jié)了分子模擬對(duì)藥物動(dòng)力學(xué)的貢獻(xiàn)，例如根據(jù)配體的藥物停留時(shí)間對(duì)其進(jìn)行排序。

       05 展望未來(lái)

       人體是不斷變化的，因此捕捉動(dòng)態(tài)藥物動(dòng)力學(xué)是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。這是復(fù)雜的，因?yàn)檫€有其他因素影響藥物動(dòng)力學(xué)。例如，動(dòng)力學(xué)選擇性，它指的是藥物結(jié)合選定靶點(diǎn)（chosen target）而非結(jié)合脫靶（off-target）的相對(duì)能力。該參數(shù)提供了對(duì)不想要的不利影響的洞察。動(dòng)力學(xué)選擇性反過(guò)來(lái)又受到熱力學(xué)性質(zhì)的影響，例如吉布斯能（Gibbs energy）和結(jié)合焓（enthalpy of binding），它們提供了驅(qū)動(dòng)藥物-靶點(diǎn)相互作用的分子間作用力的根本信息。

       進(jìn)一步證實(shí)其重要性的是，動(dòng)力學(xué)選擇性反過(guò)來(lái)會(huì)影響靶點(diǎn)易受攻擊性（target vulnerability），其定義為必須參與結(jié)合以引發(fā)所需響應(yīng)的靶點(diǎn)比例。與高易受攻擊性靶點(diǎn)相比，低易受攻擊性靶點(diǎn)需要相對(duì)較高的藥物暴露水平，才能達(dá)到藥理學(xué)相關(guān)的靶點(diǎn)參與水平。這意味著，高易受攻擊性靶點(diǎn)受到動(dòng)力學(xué)選擇性的強(qiáng)烈影響，因?yàn)楫a(chǎn)生一小部分活性靶點(diǎn)（例如靶點(diǎn)參與結(jié)合后通過(guò)藥物離解）需要更多時(shí)間。

       雖然預(yù)測(cè)藥物動(dòng)力學(xué)是復(fù)雜的，但隨著實(shí)驗(yàn)和建模方法的不斷改進(jìn)，有望做出更好的預(yù)測(cè)來(lái)提高藥物的療效和安全性。

       參考資料：Andy Tay, PhD：Assessing Kinetics in Drug Discovery