Nature子刊：清華大學藍勛/李寅青/朱明團隊開發(fā)通用型基因編輯脫靶檢測技術
近年來，隨著諸如胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和先導編輯器?（prime editor, PE）等新型基因編輯工具不斷被開發(fā)，CRISPR-Cas系統(tǒng)引領的基因編輯技術在眾多領域展現(xiàn)了巨大的應用潛力。然而，脫靶效應——即在預期目標之外產(chǎn)生的編輯——不僅影響了生物學研究的準確性，也給基因治療的臨床應用帶來了潛在的安全隱患。2023年美國FDA在審查首個CRISPR基因編輯療法的上市申請時，風險評估，尤其是脫靶效應是其關注焦點。高效且精準地檢測脫靶效應成為了基因編輯技術的關鍵挑戰(zhàn)之一。
近年來，隨著諸如胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和先導編輯器 （prime editor, PE）等新型基因編輯工具不斷被開發(fā)，CRISPR-Cas系統(tǒng)引領的基因編輯技術在眾多領域展現(xiàn)了巨大的應用潛力。然而，脫靶效應——即在預期目標之外產(chǎn)生的編輯——不僅影響了生物學研究的準確性，也給基因治療的臨床應用帶來了潛在的安全隱患。2023年美國FDA在審查首個CRISPR基因編輯療法的上市申請時，風險評估，尤其是脫靶效應是其關注焦點。高效且精準地檢測脫靶效應成為了基因編輯技術的關鍵挑戰(zhàn)之一。
為應對脫靶挑戰(zhàn)，科學界提出了多種檢測方法，包括基于生物信息學的預測、生物化學檢測和細胞水平檢測方法。然而現(xiàn)存方法普適性較低，或僅針對有限的編輯系統(tǒng)或細胞類型設計，并且大多數(shù)方法無法應用于離體及體內(nèi)編輯時的脫靶檢測。
2024年7月2日17時，清華大學醫(yī)學院藍勛團隊與藥學院李寅青團隊合作，在 Nature Biotechnology 期刊上發(fā)表了題為：Tracking-seq reveals the heterogeneity of off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome editing 的研究論文。
該研究報道了一項名為Tracking-seq的新型脫靶效應檢測技術，并借助該技術揭示了不同細胞類型、不同編輯工具間存在的脫靶效應異質(zhì)性。該研究將為基因編輯在基因治療等領域的安全應用提供重要理論參考及技術支持。
目前的主流基因編輯器均依賴于DNA損傷后的修復過程實現(xiàn)基因編輯，復制蛋白A（replication protein A，RPA）廣泛存在于基因組雙鏈及單鏈損傷修復過程，Tracking-seq通過CUT&RUN技術特異性地識別并捕獲與RPA結合的單鏈DNA（Single-stranded DNA，ssDNA），隨后利用鏈特異性核酸酶消化雙鏈DNA以提高信噪比，構建鏈特異性ssDNA文庫進行高通量測序，并通過新開發(fā)的算法精確計算RPA信號強度，進而實現(xiàn)對多種編輯工具的脫靶檢測。
圖1. Tracking-seq示意圖
相較于現(xiàn)有的GUIDE-seq和DISCOVER-seq等脫靶檢測技術，Tracking-seq不僅展現(xiàn)了高召回率，而且具備很高的檢測精確度。重要的是，其具有高度的泛用性，使其能夠適用于Cas9、CBE、ABE以及PE等各類主流基因編輯工具，并能適應不同的細胞類型及不同的編輯環(huán)境（包括體外、離體及體內(nèi)編輯）。此外，Tracking-seq的高靈敏度使其能夠在僅有數(shù)千個細胞的樣品中，有效地進行脫靶檢測，并保持優(yōu)異的結果。
圖2. Tracking-seq檢測不同編輯工具的鏈特異性信號
得益于Tracking-seq的高泛用性，該研究發(fā)現(xiàn)當使用相同的向?qū)NA時，Cas9、CBE、ABE和PE的脫靶效應存在明顯差異，其中Cas9和CBE之間觀測到了許多近似于各自特異的脫靶位點。此外，不同類型的細胞中也觀察到了脫靶效應的異質(zhì)性，脫靶事件似乎更容易在染色質(zhì)開放和活躍的區(qū)域發(fā)生。這些脫靶效應的異質(zhì)性提示，使用替代性編輯系統(tǒng)或在不同細胞類型中進行的脫靶檢測，可能無法準確反映目標細胞中實際的脫靶情況。相比之下，Tracking-seq技術能夠直接對原始編輯系統(tǒng)進行脫靶檢測，因此具有廣闊的應用潛力和前景。
肖女士
021-33392297
Kelly.Xiao@imsinoexpo.com
2006-2025 上海博華國際展覽有限公司版權所有（保留一切權利）
滬ICP備05034851號-57
