基因編輯技術(shù)的興起，尤其是 Cas9 敲入小鼠的開發(fā)，顯著加速了遺傳學(xué)、基因組學(xué)、免疫學(xué)和癌癥等多個領(lǐng)域的功能發(fā)現(xiàn)。然而，人類疾病的基因多效性和基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性需要一種能夠同時進(jìn)行多重基因編輯的敲入小鼠模型。
2025年3月20日，耶魯大學(xué)陳斯迪課題組在Nature Biomedical Engineering 期刊發(fā)表了題為：Cas12a knock-in mice for multiplexed genome editing, disease modelling and immune cell engineering的研究論文。
該研究開發(fā)出多種 Cas12a 敲入小鼠模型，助力針對復(fù)雜基因互作網(wǎng)絡(luò)，疾病建模與免疫遺傳學(xué)的研究。
在這項最新研究中，陳斯迪教授團(tuán)隊開發(fā)了一系列背景為 C57BL/6 的 Cre 依賴的條件性表達(dá)小鼠或組成性表達(dá) Cas12a 小鼠模型，包括 LbCas12a 和高保真增強(qiáng)版 AsCas12a（enAsCas12a-HF1）。
研究團(tuán)隊首先通過與 CMV-Cre 小鼠交配獲得了組成性表達(dá) Cas12a 蛋白的小鼠，驗證了 Cas12a 蛋白的表達(dá)及在不同主要器官中的表達(dá)量，并通過全鼠表型分析證實(shí) Cas12a 的組成性表達(dá)并未導(dǎo)致與 C57BL/6 背景品系相比的任何可辨別的病理差異。通過使用 LbCas12a 和 enAsCas12a 小鼠原代免疫細(xì)胞，他們在 T 細(xì)胞和骨髓來源的樹突狀細(xì)胞（BMDC）中實(shí)現(xiàn)了高效的雙基因編輯（Double Knockout）。高通量測序結(jié)果顯示，使用 enAsCas12a 小鼠系統(tǒng)可以在這些細(xì)胞類型中實(shí)現(xiàn)高達(dá) 90% 的基因編輯效率。
為了驗證 Cas12a 敲入小鼠在體內(nèi)基因編輯中的應(yīng)用，研究團(tuán)隊使用 LNP 系統(tǒng)將靶向 Ttr 基因的CRISPR RNA（crRNA）遞送到組成性表達(dá) enAsCas12a 的小鼠體內(nèi)。實(shí)驗結(jié)果顯示，注射后 6 天，血清中 TTR 蛋白水平顯著下降，并在 20 天內(nèi)保持穩(wěn)定。這表明，LNP-crRNA 系統(tǒng)在體內(nèi)具有高效的基因靶向能力。
為了進(jìn)一步驗證 Cas12a 敲入小鼠優(yōu)越的的體內(nèi)基因編輯效率及在癌癥建模中的應(yīng)用，研究團(tuán)隊設(shè)計了一個包含四個腫瘤抑制基因（Trp53、Pten、Apc和Rb1）的 AAV-crTSG 表達(dá)陣列，并通過 AAV 系統(tǒng)遞送到條件性表達(dá) enAsCas12a 小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，注射后一個月內(nèi)，所有注射 AAV-crTSG 的小鼠均在頭頸部位形成了侵襲性腫瘤，而對照組小鼠（注射AAV-vector）未觀察到腫瘤形成。組織學(xué)分析顯示，這些腫瘤具有典型的鱗狀細(xì)胞癌特征，并且腫瘤細(xì)胞中表達(dá) enAsCas12a-HF1-GFP 蛋白，表明腫瘤的形成是由 AAV-crTSG 介導(dǎo)的基因編輯引起的。
為了實(shí)現(xiàn)同步基因激活和敲除，研究團(tuán)隊將 LSL-enAsCas12a-HF1 小鼠與 dCas9-SPH 轉(zhuǎn)基因小鼠交配，生成了 LSL-enAsCas12a-HF1；dCas9-SPH 雙轉(zhuǎn)基因小鼠。雙轉(zhuǎn)基因老鼠及配合設(shè)計的一個包含 Cas9-sgRNA 和 Cas12a-crRNA 的融合引導(dǎo) RNA 系統(tǒng)，研究團(tuán)隊建立了一個同時進(jìn)行雙基因激活和敲除（DAKO）的系統(tǒng)。DAKO 系統(tǒng)的有效性在 BMDC 細(xì)胞實(shí)驗中得到驗證，流式分析實(shí)驗結(jié)果顯示，DAKO 系統(tǒng)在單個細(xì)胞水平上同時實(shí)現(xiàn)雙基因激活和敲除，為研究復(fù)雜基因相互作用網(wǎng)絡(luò)提供了強(qiáng)大的工具。
Cas12a 敲入小鼠的開發(fā)為多重基因編輯、疾病建模和免疫遺傳學(xué)研究提供了一個強(qiáng)大的平臺。這些小鼠品系及其伴隨的病毒和非病毒遞送載體，共同構(gòu)成了一個廣泛適用的工具包，能夠應(yīng)用于基因編輯、免疫細(xì)胞工程、免疫學(xué)發(fā)現(xiàn)和復(fù)雜基因相互作用的解卷積。隨著遞送載體的優(yōu)化及靶點(diǎn)組合的精確設(shè)計，Cas12a 敲入小鼠有望在臨床治療中發(fā)揮重要作用，不僅應(yīng)用于腫瘤治療，還可擴(kuò)展至其他疾病領(lǐng)域，為精準(zhǔn)個性化治療和通用治療鋪平道路。
該研究由耶魯大學(xué)陳斯迪教授課題組主導(dǎo)完成，耶魯大學(xué)博士學(xué)生唐開元和周立群為該論文的共同第一作者。陳斯迪教授、約翰·霍普金斯醫(yī)學(xué)院Matthew Dong，以及即將成為威斯塔研究所（The Wistar Institute）獨(dú)立PI的周小宇博士為該論文的共同通訊作者。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41551-025-01371-2
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