哺乳動物著床前胚胎發(fā)育是生命起始的關鍵階段。在這一過程中，具有全能性的受精卵會經(jīng)歷全基因組范圍的表觀遺傳重編程，通過精細的時空調控，逐步發(fā)育成完整胚胎以及多種胚外組織。這一過程涉及一系列關鍵發(fā)育事件：母代-子代轉換（Maternal-to-zygotic transition，MZT）、合子基因組激活（Zygotic genome activation，ZGA）、第一次細胞命運決定分化形成滋養(yǎng)外胚層（Trophectoderm，TE）和多能性的內細胞團 （Inner cell mass，ICM），以及第二次細胞命運決定由內細胞團進一步分化為原始內胚層（Primitive endoderm，PE）和多能性的上胚層（Epiblast，EPI）等。此外，在雌性小鼠胚胎中，還需通過父本X染色體的印記失活（imprinted X chromosome inactivation，iXCI）維持X染色體基因劑量的平衡。這些精密的發(fā)育過程依賴于數(shù)十萬個復雜的順式調控元件和數(shù)百個轉錄因子構成的協(xié)同調控網(wǎng)絡。

然而，由于技術限制，目前對哺乳動物早期胚胎發(fā)育的染色質可及性研究仍然停留在群體細胞水平。著床前胚胎中細胞數(shù)量稀少且難以獲得，同時在囊胚期已經(jīng)完成兩次細胞譜系分化，其染色質狀態(tài)具有瞬時性和快速時空動態(tài)變化等特征。群體細胞水平（bulk-level）的組學研究難以精確解析不同譜系細胞的染色質狀態(tài)、胚胎內部異質性等染色質時空動態(tài)變化。因此，以單細胞分辨率對哺乳動物著床前胚胎染色質狀態(tài)進行深入研究是一個亟待解決的問題。

ATAC-seq（Assay for Transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing）是研究染色質可及性和順式調控元件的核心工具之一。現(xiàn)有的單細胞 ATAC-seq 方法雖然最后實現(xiàn)的是單個細胞的染色質可及性測序，但是需要至少數(shù)千個細胞作為起始材料，因而難以對哺乳動物著床前胚胎進行單細胞水平的解析。此外，傳統(tǒng)的短讀段 ATAC-seq 技術對于檢測著床前胚胎發(fā)育過程中激活且發(fā)生動態(tài)變化的重復元件存在局限性。來自重復元件的短讀段可能比對到多個基因組位點，從而因為歧義比對而在序列比對后被質控過濾掉，導致這些基因組區(qū)域的表觀遺傳景觀一直處于未知狀態(tài)。此外，短讀段 ATAC-seq 技術覆蓋的遺傳變異有限，區(qū)分父母本等位基因的效率低下，限制了對基因組印記的研究。

2023年，湯富酬課題組開發(fā)了首個基于單分子長讀段測序平臺的單細胞 scNanoATAC-seq 技術，大大提高了 ATAC-seq 技術檢測重復元件染色質可及性和等位基因特異性染色質可及性方面的分析能力。雖然該技術最后實現(xiàn)的是單個細胞的染色質可及性測序，但是仍需要數(shù)萬個細胞作為起始材料，這嚴重限制了其在哺乳動物著床前胚胎發(fā)育中的應用。

2025年3月28日，北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）湯富酬課題組與清華大學基礎醫(yī)學院紀家葵課題組合作，在國際頂尖學術期刊 Science 上發(fā)表了題為：Chromatin Accessibility Landscape of Mouse Early Embryos Revealed by Single-cell NanoATAC-seq2 的研究論文。

該研究首次報道了適用于單細胞樣本起始的 ATAC-seq 技術——scNanoATAC-seq2。

該技術開發(fā)了創(chuàng)新的單管反應體系，將多個實驗步驟集成在單個反應管中完成，最大 程度降低了樣品損失。通過長片段富集，極大降低了文庫的線粒體 DNA 污染比率，實現(xiàn)了從單個細胞起始樣本獲取高質量的染色質可及性信息。研究團隊采用 scNanoATAC-seq2 技術對小鼠著床前胚胎各發(fā)育階段進行了系統(tǒng)、深入的單細胞分辨率染色質可及性分析（圖1）。

圖1. scNanoATAC-seq2對小鼠著床前胚胎發(fā)育十個關鍵階段進行單細胞染色質可及性分析

該研究的重要發(fā)現(xiàn)如下：

1、確立了X染色體印記失活和重新激活的表觀調控基礎

X 染色體上調控X染色體失活現(xiàn)象的有兩個相鄰的主要拓撲相關結構域：促進X染色體失活的 X-ist 結構域和抑制X染色體失活的 Tsix 結構域。Xist結構域包含 X-ist、Jpx、Ftx 和 Rlim 等重要調控基因，其表達主要促進所在 X 染色體的失活。而 Tsix 結構域包含 Tsix、Tsx 和 Linx 等重要調控基因，其表達主要抑制所在 X 染色體的失活，即促進或維持該條 X 染色體的激活狀態(tài)。

利用兩種近交系小鼠交配產生的雜合胚胎進行分析，該研究發(fā)現(xiàn)，在 4 細胞胚胎階段開始的父本 X 染色體印記失活過程中，X-ist 結構域特異性增強父本 X 染色體在該區(qū)域的染色質開放性，從而促進整條父本 X 染色體的印記失活。而此時 Tsix 結構域保持父本和母本 X 染色體在該區(qū)域的對稱開放性，不參與父本 X 染色體的特異性印記失活（圖2）。發(fā)育到早期桑椹胚階段時，這一狀態(tài)發(fā)生逆轉，X-ist 結構域逐漸轉變?yōu)楦副竞湍副?X 染色體在該區(qū)域的對稱開放性，而 Tsix 結構域逐漸特異性增強母本 X 染色體在該區(qū)域的染色質開放性，保持母本 X 染色體處于活躍狀態(tài)，而仍然使整條父本 X 染色體維持印記失活狀態(tài)（圖2）。此后，在晚期囊胚階段，在兩個胚外譜系的細胞（滋養(yǎng)外胚層和原始內胚層）中保持這一由 Tsix 結構域主導的父本X染色體印記失活狀態(tài)。而在多能性的上胚層細胞中Tsix結構域重新逆轉回父本和母本 X 染色體在該區(qū)域的對稱開放性，印記失活的父本 X 染色體被重新激活，但是其激活程度仍然略低于母本 X 染色體。

圖2. X-ist與Tsix結構域調控父本X染色體印記失活和重新激活。

2、鑒定了調控合子基因組激活和早期胚胎兩次譜系命運決定的關鍵轉錄因子

對于結合基序已知的轉錄因子，通過分析其結合位點的染色質狀態(tài)，ATAC-seq 可以準確鑒定每個轉錄因子的調控活性，準確判斷對應關鍵生物學事件的主導轉錄因子。通過對從受精卵到晚期囊胚的十個關鍵發(fā)育階段的分析，包括受精卵、早期2細胞、晚期2細胞、4細胞、早期8細胞、晚期8細胞、16細胞（早期桑葚胚）、晚期桑椹胚期、早期囊胚和晚期囊胚，該研究準確鑒定了該過程中每個發(fā)育階段和每個分化譜系的關鍵轉錄因子（圖3）。scNanoATAC-seq2 分析提示，這些轉錄因子的基因體和轉錄因子下游結合位點上的表觀激活程度在發(fā)育過程中協(xié)同變化。這為后續(xù)通過基因敲除等手段對每個主導轉錄因子的功能進行精細分析奠定了基礎，也為研究著床前胚胎的每個發(fā)育階段的核心轉錄因子網(wǎng)絡提供了表觀組學依據(jù)。

圖3. 調控小鼠著床前胚胎各階段發(fā)育的主導轉錄因子

3、揭示了主要重復元件類別在早期胚胎發(fā)育過程中的表觀調控特點

哺乳動物基因組中大約一半都是由重復元件組成的。一些重要類型的重復元件在基因組中有數(shù)千個序列幾乎一模一樣的拷貝，分散分布在整個基因組中。例如全長 LINE1 重復元件拷貝的長度在 6 kb 左右，同一亞家族內兩個拷貝之間的序列相似度能夠達到 99% 以上。二代短讀段測序很難區(qū)分這些不同的拷貝，因而無法判斷其染色質狀態(tài)（圖4）。該研究發(fā)現(xiàn)大部分全長 LINE1 在卵裂期染色質開放度下降，而后在囊胚期上升。然而，存在 157 個調控模式相反的全長 LINE1 拷貝，其染色質開放度在卵裂期上升，而后在囊胚期下降，可能涉及常染色質-異染色質的區(qū)室形成。

MERVL 屬于長末端重復序列（long terminal repeat，LTR）家族，全長約 6kb，中間為內源逆轉錄病毒（endogenous retrovirus，ERV）蛋白編碼序列，兩端為輔助轉座和順式調控的 MT2-mm 元件。先前的研究表明，這類轉座子在合子基因組激活過程中被廣泛激活并轉錄，人為沉默 MERVL 會導致小鼠著床前發(fā)育異常。由于小鼠基因組中 570 個完整 MERVL 元件的序列高度相似，短讀段測序技術難以實現(xiàn)唯一比對。利用 5 kb 以上的長讀段（涵蓋MERVL側翼的非重復序列），scNanoATAC-seq2 能夠實現(xiàn) MERVL 來源 DNA 片段的唯一比對，從而精確描繪每個拷貝的 MERVL 的表觀激活特征。在晚期2細胞階段發(fā)生的合子基因組激活中，MERVL 的表觀激活發(fā)生于兩端的 MT2-mm 重復元件，而內部的 ERV 編碼序列所在的染色質保持相對關閉狀態(tài)。此外，逐個拷貝分析的染色質可及性表明，這些序列相似的 MERVL 元件之間仍存在表觀激活程度的差異。在 scNanoATAC-seq2 鑒定的活躍 MERVL 元件附近（30 kb以內），相應的靶基因呈現(xiàn) ZGA 表達激活（如Zscan4c、Zscan4d和Sp110）；相反，表觀遺傳沉默的 MERVL 元件附近基因的表達則在 ZGA 過程中未激活。

圖4. scNanoATAC-seq2鑒定序列高度相似的不同拷貝重復元件的染色質狀態(tài)

4、鑒定了一批新的小鼠早期胚胎非經(jīng)典印記基因

scNanoATAC-seq2 技術能夠高效區(qū)分父、母本等位基因，適合研究發(fā)育中的基因印記。在 C57×DBA 和 C57×CAST 雜合胚胎中，該研究分別識別了 47% 和 97% 的染色質可及性的親本來源。利用這些數(shù)據(jù)，該研究描繪了染色質可及性介導的非經(jīng)典印記的動態(tài)變化（不依賴DNA甲基化）。結果顯示，非經(jīng)典印記強度在著床前發(fā)育過程中逐漸消失，并在晚期囊胚譜系分化后降至最低水平。該研究最晚在8細胞胚胎階段觀測到較強的等位基因特異性染色質可及性。由此，通過反交胚胎驗證，研究人員在該發(fā)育階段鑒定出 325 個小鼠非經(jīng)典印記基因。其中 266 個基因是相較于 Inoue 等人的研究新鑒定出來的父源非經(jīng)典印記基因。Inoue 等人的研究是基于孤雌和孤雄小鼠桑葚胚的染色質可及性差異，而不是基于正常胚胎發(fā)育過程的等位基因特異性染色質可及性分析得出的。

5、發(fā)現(xiàn)16細胞胚胎階段已經(jīng)出現(xiàn)胚內和胚外譜系分化的染色質可及性特征

該研究鑒定了早期囊胚中內細胞團和滋養(yǎng)外胚層譜系特異性的染色質開放區(qū)域特征，并且以此為基礎解析其他發(fā)育階段的胚內異質性。結果表明，小鼠胚胎發(fā)育至16細胞階段時，首次出現(xiàn)了表觀基因組層面的內細胞團和滋養(yǎng)外胚層命運分化特征（圖5）。這提示在囊胚腔出現(xiàn)之前，囊胚中兩種譜系的分化特征已然在16細胞胚胎（早期桑葚胚）階段的染色質可及性層面出現(xiàn)。

圖6. 小鼠胚胎發(fā)育16細胞期出現(xiàn)細胞譜系分化的染色質可及性特征

總之，該研究利用單細胞起始的 scNanoATAC-seq2 技術，構建了涵蓋小鼠著床前發(fā)育全過程的高精度單細胞染色質可及性圖譜，系統(tǒng)鑒定了不同發(fā)育階段、不同譜系細胞的關鍵轉錄因子，揭示了調控合子基因組激活和譜系分化（上胚層、原始內胚層和滋養(yǎng)外胚層）的順式調控網(wǎng)絡。此外，還解析了雌性胚胎中父本 X 染色體的印記失活與重新激活，以及非經(jīng)典印記基因的表觀調控基礎。這些發(fā)現(xiàn)為理解包括人類在內的哺乳動物早期胚胎發(fā)育的分子機制提供了新的線索。

北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心湯富酬研究員、文路副研究員與清華大學基礎醫(yī)學院紀家葵研究員為該論文的共同通訊作者。清華大學基礎醫(yī)學院博士生李孟瑤博士（已畢業(yè)）與北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心博士生蔣振寰為該論文的并列第一作者。

論文鏈接：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adp4319