嵌合抗原受體（CAR）-T細(xì)胞療法已顯示出強(qiáng)大的治愈潛力，并成為一系列B細(xì)胞惡性腫瘤治療的關(guān)鍵組成部分。CAR-T細(xì)胞療法成功用于治療血液癌和實(shí)體癌以及自身免疫性疾病等其他適應(yīng)癥，取決于有效的CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)，這不僅會影響產(chǎn)品的安全性和有效性，還會影響有需要的患者的整體可及性。這篇綜述討論了自體CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)的主要工藝參數(shù)，以及監(jiān)管考慮因素和正在進(jìn)行的發(fā)展，這些因素將使下一代CAR-T細(xì)胞療法成為可能。

       【NO.1】介紹

       文中描述了幾種FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝，具有廣泛的相似性和獨(dú)特性（表1）。整個過程包括從白細(xì)胞分離法產(chǎn)物中分離起始細(xì)胞群、T細(xì)胞活化、基因修飾、離體擴(kuò)增、最終產(chǎn)品配方和產(chǎn)品放行測試（圖1）。本綜述旨在概述每個關(guān)鍵生產(chǎn)步驟中的工藝參數(shù)如何影響所得細(xì)胞產(chǎn)品，并討論有可能在治療效果和患者可及性方面顯著改變CAR-T細(xì)胞療法格局的下一代生產(chǎn)策略。

       表1.FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)總結(jié)

       【NO.2】選擇起始細(xì)胞群

       選擇CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)的起始細(xì)胞群是一個早期決策點(diǎn)，對生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品有重大影響。自體CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)過程通常從純化形式的成熟T細(xì)胞開始，或作為外周血單核細(xì)胞（PBMC）群體的一部分。成熟T細(xì)胞從初始（TN）表型分化為干細(xì)胞記憶（TSCM）、中樞記憶（TCM）、效應(yīng)記憶（TEM）、效應(yīng)（TE）和耗竭（TEXH）細(xì)胞。此外，T細(xì)胞可分為CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、CD4+輔助性T細(xì)胞和CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。在輔助性T細(xì)胞類別中，可以進(jìn)一步識別亞群，例如Th1、Th2、Th17和濾泡輔助細(xì)胞。T細(xì)胞表型的多樣性使起始細(xì)胞群的選擇成為CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)中的主要工藝參數(shù)。然而，生物學(xué)并不是影響起始材料選擇的唯一因素，因?yàn)榛颊叩呐R床病史和健康狀況也對可以獲得的細(xì)胞生產(chǎn)材料施加了實(shí)際限制。

       圖1.自體CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)過程示意圖，自體CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)通常涉及初始細(xì)胞分離、T細(xì)胞活化、CAR轉(zhuǎn)基因（或mRNA）的引入、細(xì)胞擴(kuò)增和最終制劑。大多數(shù)產(chǎn)品在輸注到患者體內(nèi)之前在床邊冷凍保存和解凍。傳統(tǒng)的制造工藝通常涉及1-2周的離體細(xì)胞作和擴(kuò)增，而簡化的制造工藝可以將離體時間縮短到24-72小時。然而，由于運(yùn)輸、產(chǎn)品放行測試和患者臨床護(hù)理考慮所需的時間，實(shí)際的靜脈到靜脈時間可能會長得多。

       【NO.3】CD4+與CD8+T細(xì)胞

       CAR-T細(xì)胞通過CAR抗原結(jié)合直接激活，無需輔助受體與MHC分子結(jié)合。因此，CAR-T細(xì)胞功能原則上不需要CD4和CD8分子作為輔助受體。CAR-T細(xì)胞的早期開發(fā)工作考慮了選擇性富集CD8+T細(xì)胞以最大限度地提高細(xì)胞毒性的優(yōu)勢。然而，CD4+輔助性T細(xì)胞在促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)功能、擴(kuò)增和持久性方面也起著關(guān)鍵作用，并且已經(jīng)表明CD4+T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的存在導(dǎo)致CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的募集、增殖和功能增加。因此，目前批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品都含有CD4+和CD8+T細(xì)胞，盡管采用了不同的生產(chǎn)方法。

       細(xì)胞分離通常通過基于磁珠的細(xì)胞分選來實(shí)現(xiàn)。CD4+和CD8+細(xì)胞的混合物可以通過去除非T細(xì)胞或使用CD4和CD8結(jié)合微珠的組合進(jìn)行陽性選擇來分離。分離混合T細(xì)胞群的過程相對簡化，與平行生產(chǎn)單獨(dú)的CD4+和CD8+細(xì)胞培養(yǎng)物相比，可以以更低的成本完成，但它排除了在最終產(chǎn)品中精確控制CD4：CD8比率的可能性?；蛘撸珻D4+和CD8+T細(xì)胞可以單獨(dú)分離和培養(yǎng)，從而可以配制具有精確CD4：CD8比率的最終產(chǎn)品。但是，這種方法的代價是增加勞動力、時間和生產(chǎn)成本。此外，最佳的CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增需要CD4+T細(xì)胞的存在，這使得分離的CD8+T細(xì)胞的生產(chǎn)容易出現(xiàn)生產(chǎn)失敗。應(yīng)對這一挑戰(zhàn)的一個潛在解決方案是分別分離CD4+和CD8+T細(xì)胞，但以規(guī)定的起始比例共培養(yǎng)，目的是產(chǎn)生具有大致所需比例的CD4：CD8T細(xì)胞的最終細(xì)胞產(chǎn)品。這種策略已被證明可以克服CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增的困難，導(dǎo)致與單獨(dú)培養(yǎng)的CD4+和CD8+T細(xì)胞相比，小鼠的產(chǎn)物具有更高的細(xì)胞毒功能。然而，這種"定義"的生產(chǎn)方法并不能完全防止生產(chǎn)失敗。重要的是，在產(chǎn)品中產(chǎn)生所需的最終比例所需的起始CD4：CD8比率可能因供體而異，因此這種方法仍然難以實(shí)現(xiàn)精確的產(chǎn)品特征。

       【NO.4】T細(xì)胞分化狀態(tài)

       除了CD4：CD8比率之外，T細(xì)胞產(chǎn)物的分化狀態(tài)已被證明與抗腫瘤療效特征相關(guān)。在抗原刺激后，T細(xì)胞經(jīng)歷克隆擴(kuò)增，一個亞群分化成TE細(xì)胞，TE細(xì)胞具有強(qiáng)大的細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子產(chǎn)生能力，但壽命相對較短，相比之下，活化的T細(xì)胞亞群變成記憶T細(xì)胞，這些細(xì)胞壽命長，響應(yīng)繼生抗原攻擊而迅速激活。與終末分化的TE細(xì)胞相比，TN、TSCM和TCM細(xì)胞具有更大的長期持續(xù)潛力并產(chǎn)生較低水平的炎性細(xì)胞因子，它們可以共同實(shí)現(xiàn)持久的抗腫瘤反應(yīng)，同時避免嚴(yán)重的急性毒性，如細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）。這些發(fā)現(xiàn)支持了對從富集幼稚和記憶T細(xì)胞開始的生產(chǎn)過程的探索，早期證據(jù)表明此類產(chǎn)品可以實(shí)現(xiàn)強(qiáng)大的療效和良好的安全性。

       CD45RA、CD45RO、CD62L和CCR7的表面表達(dá)通常用于識別T細(xì)胞亞型，并且可以通過選擇CD62L+細(xì)胞從白細(xì)胞去除術(shù)產(chǎn)物中分離出幼稚和記憶T細(xì)胞。然而，CD62L+選擇可同時導(dǎo)致同樣表達(dá)CD62L的CD14+髓系細(xì)胞和CD25+Treg的意外富集。髓系細(xì)胞已被證明會顯著降低T細(xì)胞活化和隨后的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率，這可能是由于用于激活T細(xì)胞的抗CD3/CD28磁珠的吞噬作用。此外，據(jù)報道，CAR-T產(chǎn)品中存在Tregs與抗腫瘤療效差相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，CAR-T產(chǎn)品可能受益于CD14+和CD25+細(xì)胞類型在CD62L+細(xì)胞富集之前耗盡，并且在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)（例如，NCT02208362和NCT04007029）中評估了使用CD14-/CD25-/CD62L+細(xì)胞作為CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)的起始材料。

       出乎意料的是，一項(xiàng)試驗(yàn)（NCT04007029）的數(shù)據(jù)顯示，在CD62L富集之前未耗盡CD14+和CD25+細(xì)胞的起始群體制成的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)物與由CD14/CD25耗盡的起始群體制成的產(chǎn)品相比，具有相似的活化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、擴(kuò)增和最終CD3+純度水平。由非CD14/CD25耗盡細(xì)胞制成的產(chǎn)品在細(xì)胞生產(chǎn)結(jié)束時顯示CD4+T細(xì)胞中明顯富集，但基于該1期試驗(yàn)中的少量患者，由CD14/CD25耗盡或未耗盡起始細(xì)胞群制成的細(xì)胞產(chǎn)品之間未觀察到治療結(jié)果的顯著差異。值得注意的是，該特定臨床試驗(yàn)中使用的細(xì)胞生產(chǎn)過程使用聚合物納米基質(zhì)T細(xì)胞興奮劑而不是基于磁珠的激活試劑，并且髓系細(xì)胞對不同大小和剛度的激活試劑表現(xiàn)出的差異吞噬反應(yīng)可能在所得細(xì)胞產(chǎn)物的行為中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

       【NO.5】T細(xì)胞活化方法

       T細(xì)胞活化對于細(xì)胞生產(chǎn)過程的成功至關(guān)重要，因?yàn)樗苯佑绊慍AR轉(zhuǎn)基因整合的效率以及離體培養(yǎng)期間的T細(xì)胞擴(kuò)增。T細(xì)胞活化通常是通過刺激CD3和CD28結(jié)合細(xì)胞因子支持來實(shí)現(xiàn)的。CD3信號傳導(dǎo)（信號1）觸發(fā)T細(xì)胞活化，而CD28信號傳導(dǎo)提供必要的共刺激（信號2）以避免無反應(yīng)。此外，細(xì)胞因子混合物（信號3）--最常見的是IL-2、IL-7和/或IL-15--用于支持T細(xì)胞擴(kuò)增。目前，生產(chǎn)方案通常使用涂有抗CD3和抗CD28抗體的磁珠或膠體聚合物納米基質(zhì)來提供信號1和2。磁珠提供固體支持，模擬呈遞肽-MHC復(fù)合物和共刺激配體的靶細(xì)胞以進(jìn)行T細(xì)胞結(jié)合，抗CD3/CD28磁珠可同時用作基于磁性的細(xì)胞分選的T細(xì)胞分離劑。然而，磁珠容易被髓細(xì)胞吞噬，因此使用抗CD3/CD28珠子進(jìn)行細(xì)胞分選存在CD14+細(xì)胞富集的風(fēng)險，同時減少了可用于刺激T細(xì)胞的激活試劑的數(shù)量。此外，在回輸之前，需要通過磁分離進(jìn)行去珠步驟以生成純CAR-T細(xì)胞產(chǎn)物。相比之下，膠體聚合物納米基質(zhì)似乎不太容易被髓系細(xì)胞消除，并且可以通過簡單的離心去除。然而，尚未報道這些試劑的頭對頭比較，無法對所得細(xì)胞產(chǎn)物進(jìn)行嚴(yán)格比較。

       無論形式如何，市售活化劑都是以固定磁珠：細(xì)胞比例或每體積稀釋比例應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)品。最近的發(fā)展探索了根據(jù)患者的疾病類型為每種產(chǎn)品量身定制的個性化T細(xì)胞活化試劑的可能性。例如，利用涂有脂質(zhì)雙層的介孔二氧化硅微棒，Mooney及其同事開發(fā)了APC模擬支架，該支架不僅可以提供抗CD3和-CD28信號，還可以實(shí)現(xiàn)IL-2的持續(xù)釋放。可以精確調(diào)整抗CD3和-CD28抗體的密度，以提供最佳刺激強(qiáng)度，從而最大限度地提高T細(xì)胞適應(yīng)性。實(shí)施經(jīng)過微調(diào)、高度個性化的試劑必須與生產(chǎn)通量和工藝穩(wěn)健性的實(shí)際考慮相平衡。盡管如此，可以適應(yīng)不同產(chǎn)品要求的"智能"材料的出現(xiàn)可以顯著提高生產(chǎn)過程的靈活性和質(zhì)量。

       應(yīng)該注意的是，盡管T細(xì)胞活化是當(dāng)今CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)中不可或缺的步驟，但下一代生產(chǎn)工藝正在考慮消除T細(xì)胞活化的可能性。例如，最近的一份報告描述了慢病毒載體成功轉(zhuǎn)導(dǎo)未活化的T細(xì)胞。

       【NO.6】CAR轉(zhuǎn)基因

       CAR轉(zhuǎn)基因遞送方法可以顯著影響CAR轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平以及遺傳毒性，進(jìn)而影響所得CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的安全性和有效性。在本節(jié)中，我們廣泛評估了CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)的病毒和非病毒基因遞送方法。

       6.1病毒基因遞送

       目前，所有FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品都使用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)CAR轉(zhuǎn)基因整合。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)受益于相對較高的整合效率，表達(dá)穩(wěn)定整合的CAR構(gòu)建體的T細(xì)胞已被證明在T細(xì)胞輸注后持續(xù)>10年。然而，病毒整合的轉(zhuǎn)基因缺乏插入位點(diǎn)特異性，存在插入誘變的理論風(fēng)險。一項(xiàng)全基因組分析研究比較了用γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與慢病毒載體制成的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)，結(jié)果表明，與逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，慢病毒載體更有可能整合到內(nèi)含子和基因間區(qū)域;相比之下，逆轉(zhuǎn)錄病毒整合到啟動子、非翻譯區(qū)和外顯子區(qū)的頻率更高，導(dǎo)致對mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響更大。值得注意的是，迄今為止還沒有報道病毒整合導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞致癌轉(zhuǎn)化的實(shí)例。相反，一項(xiàng)案例研究報告了一名患者，其對CD19CAR-T細(xì)胞療法的反應(yīng)似乎與單個CAR-T細(xì)胞克隆的擴(kuò)增相關(guān)，該克隆的CAR轉(zhuǎn)基因隨機(jī)插入TET2基因座，從而敲除唯一功能性的TET2拷貝，因?yàn)樵摶颊咴诹硪粋€TET2等位基因中具有先天性錯義突變。同樣，在B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病患者（B-ALL）。盡管這些病例表明隨機(jī)插入可能會偶然導(dǎo)致積極的治療結(jié)果，但插入到不需要的基因座的風(fēng)險仍然是探索可以確保位點(diǎn)特異性的替代轉(zhuǎn)基因整合策略的動機(jī)。

       除了整合位點(diǎn)的考慮外，病毒載體還以具有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒（RCR）和慢病毒（RCL）的形式存在另一種潛在風(fēng)險。因此，F(xiàn)DA要求對病毒載體以及病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)行RCR/RCL檢測測定。然而，迄今為止，尚未在臨床CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品中檢測到RCR和RCL的報道，并且平衡RCR/RCL測試造成的成本和潛在延遲與此類分析的實(shí)際好處仍然是一個積極科學(xué)探索的話題。

       盡管病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)原則上可以實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但在患者細(xì)胞產(chǎn)品中實(shí)現(xiàn)一致水平的轉(zhuǎn)基因整合是一項(xiàng)技術(shù)挑戰(zhàn)。事實(shí)上，10%或更低的CAR陽性率--基于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞在抗原暴露后將在體內(nèi)擴(kuò)增的前提設(shè)定的水平--作為臨床試驗(yàn)中使用的細(xì)胞產(chǎn)品中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的最低閾值并不少見。為了最大限度地降低由于轉(zhuǎn)基因表達(dá)不良而導(dǎo)致生產(chǎn)失敗的風(fēng)險，生產(chǎn)方案可以結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑的使用，例如硫酸魚精蛋白、retronectin和泊洛沙姆。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)中的限速步驟是病毒顆粒最初附著在細(xì)胞膜上，這一過程可以通過使用retronectin進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和聚陽離子（如硫酸魚精蛋白）進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)來促進(jìn)。聚陽離子充當(dāng)將病毒連接到細(xì)胞表面的靜電橋。然而，硫酸魚精蛋白對T細(xì)胞的毒性與提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的好處相抵消。相比之下，retronectin不會導(dǎo)致T細(xì)胞毒性，但其使用僅限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。已經(jīng)開發(fā)了具有更有利毒性特征的專有轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑，盡管它們的高成本和專有訪問可能會阻礙廣泛使用。

       除了病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物學(xué)特性外，實(shí)際考慮也會影響病毒在CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)中的使用。能夠生產(chǎn)臨床級病毒的認(rèn)證設(shè)施數(shù)量仍然有限。因此，病毒生產(chǎn)所需的時間和財務(wù)成本可能成為研究藥物開發(fā)和商業(yè)CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)的瓶頸，突出了可能更靈活且更具成本效益的替代非病毒遞送系統(tǒng)的吸引力。

       6.2非病毒基因遞送

       在CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)的背景下，已經(jīng)探索了幾種不同的非病毒基因遞送方法，包括CRISPR/Cas9、轉(zhuǎn)座子和mRNA轉(zhuǎn)染。CRISPR/Cas9作為一種有效的基因組修飾方法已被廣泛采用，其增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞療法的潛力并未被忽視。為了實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性基因修飾，Cas9核酸酶與單向?qū)NA（sgRNA）復(fù)合，通過與sgRNA的序列互補(bǔ)性識別基因組DNA上的靶位點(diǎn)，并引入雙鏈DNA斷裂。接下來，通過編碼所需轉(zhuǎn)基因（例如CAR）和基因組切割位點(diǎn)的DNA模板之間的同源重組來促進(jìn)轉(zhuǎn)基因插入。

       指定轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)的能力為工程化具有所需功能的T細(xì)胞開辟了新的可能性。已經(jīng)通過計算確定了許多基因外"安全港"位點(diǎn)并進(jìn)行了實(shí)證測試，以支持T細(xì)胞的精確基因改造以實(shí)現(xiàn)治療功能。特別是，已經(jīng)表明CAR轉(zhuǎn)基因可以使用腺相關(guān)病毒載體作為同源定向修復(fù)模板有效地整合到編碼內(nèi)源性TCRα鏈的TRAC基因座中。這種策略征用了響應(yīng)T細(xì)胞激活狀態(tài)動態(tài)控制TCR表達(dá)水平的內(nèi)源性基因調(diào)控機(jī)制，數(shù)據(jù)表明所得的CAR-T細(xì)胞可能比病毒整合的CAR-T細(xì)胞更有效。此外，基于非病毒CRISPR/Cas9的基因編輯策略也被用于用腫瘤特異性TCR取代內(nèi)源性TCR，從而能夠開發(fā)高度個性化的T細(xì)胞療法。作為另一個例子，上述涉及TET2突變的案例研究激發(fā)了隨后對有意將CAR轉(zhuǎn)基因整合到TET2位點(diǎn)作為增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞增殖和持久性的一種手段的評估。有趣的是，結(jié)果表明，TET2破壞對體內(nèi)抗腫瘤療效的益處因表達(dá)的特定CAR構(gòu)建體而異，這與CAR整合到TRAC基因座中的類似發(fā)現(xiàn)相呼應(yīng)，并強(qiáng)調(diào)了確定CAR轉(zhuǎn)基因最佳整合位點(diǎn)的非平凡性質(zhì)。

       除了促進(jìn)位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)基因整合外，CRISPR/Cas9還與病毒整合結(jié)合使用，以敲除不需要的內(nèi)源性基因，同時非位點(diǎn)特異性整合編碼腫瘤靶向受體的轉(zhuǎn)基因。例如，第一個涉及CRISPR/Cas9編輯的T細(xì)胞的FDA批準(zhǔn)的臨床試驗(yàn)利用了一種生產(chǎn)工藝，該工藝用CRISPR/Cas9敲除PD-1和內(nèi)源性TCR，同時慢病毒整合了靶向NY-ESO-1的轉(zhuǎn)基因TCR。值得注意的是，據(jù)觀察，輸注后PDCD1基因座突變的NY-ESOTCR表達(dá)細(xì)胞的頻率隨著時間的推移而降低，這表明PD-1編輯的T細(xì)胞可能缺乏形成長期記憶的能力。在另一項(xiàng)1期臨床研究中，CRISPR/Cas9用于敲除PD-1和TCRα鏈，同時慢病毒整合靶向間皮素的CAR。盡管兩項(xiàng)研究都顯示出可接受的安全性，但都沒有導(dǎo)致療效的顯著改善，突出了持續(xù)改進(jìn)的必要性。此外，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的雙鏈DNA斷裂帶來了意外基因組變化的重要風(fēng)險，需要仔細(xì)分析和質(zhì)量控制，最近的一項(xiàng)研究揭示了Cas9工程CAR-T細(xì)胞中染色體丟失的可能性。有趣的是，同一項(xiàng)研究觀察到，特定的作順序會影響染色體丟失的頻率，如果在T細(xì)胞被激活之前進(jìn)行Cas9介導(dǎo)的雙鏈斷裂，則可以減少染色體丟失的頻率。

       作為CRISPR/Cas9的替代品，轉(zhuǎn)座子也被用于實(shí)現(xiàn)CAR轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合到T細(xì)胞產(chǎn)品中。特別是，piggyBac和睡美人（SB）轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已在臨床環(huán)境中進(jìn)行了評估。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)執(zhí)行"剪切和粘貼"過程，其中轉(zhuǎn)座酶與靶基因元件兩側(cè)的末端反向重復(fù)序列（即轉(zhuǎn)座子）結(jié)合，通過雙鏈DNA斷裂切除轉(zhuǎn)座子，并將轉(zhuǎn)座子重新整合到合適的基因組位點(diǎn)（例如，在SB轉(zhuǎn)座子的情況下，包含AT二核苷酸的回文序列）。通過這種方式進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因整合不是位點(diǎn)特異性的，據(jù)報道，piggyBac轉(zhuǎn)座酶表現(xiàn)出類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)先插入轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，再次增加了插入誘變的潛在風(fēng)險。在一項(xiàng)1期臨床試驗(yàn)中，兩名接受piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)產(chǎn)生的同種異體CD19CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品治療的患者患上了CAR-T細(xì)胞衍生的淋巴瘤，導(dǎo)致一人死亡。事后分析表明，惡性CAR-T細(xì)胞不包含轉(zhuǎn)基因插入已知的致癌位點(diǎn)，但顯示出多條染色體的顯著拷貝數(shù)增加和丟失以及來自轉(zhuǎn)基因啟動子的轉(zhuǎn)錄通讀。重要的是，導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物具有異常高的載體拷貝數(shù)（VCN），其中一種產(chǎn)物的VCN為25。相比之下，在沒有產(chǎn)品特定理由的情況下，F(xiàn)DA推薦的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)品的最大拷貝數(shù)為每個轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞5個拷貝。

       消除致癌插入風(fēng)險的一種策略是避免編碼CAR的轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定整合，而是從mRNA模板瞬時表達(dá)CAR。除了消除遺傳毒性的風(fēng)險外，mRNA的瞬時CAR表達(dá)也被探索為降低潛在毒性的一種手段，特別是當(dāng)CAR靶向也存在于健康組織中的抗原時。編碼轉(zhuǎn)基因的mRNA模板通常通過電穿孔遞送到T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)基因表達(dá)持續(xù)約1周，電穿孔后表達(dá)水平每天下降。因此，瞬時基因表達(dá)的潛在安全優(yōu)勢必須與治療的短暫性質(zhì)相平衡。臨床評估表明，mRNA編碼的CAR-T細(xì)胞是安全的，并且可以表現(xiàn)出抗腫瘤功效，但實(shí)現(xiàn)完全和持久的腫瘤控制的能力仍然是一個研究領(lǐng)域。

       【NO.7】離體細(xì)胞擴(kuò)增

       一旦T細(xì)胞被修飾以表達(dá)CAR轉(zhuǎn)基因，產(chǎn)物必須擴(kuò)增到足夠大的數(shù)量，以滿足給藥所需的劑量。此擴(kuò)展期的持續(xù)時間因不同的方案而異，但典型的過程從T細(xì)胞活化到細(xì)胞收獲持續(xù)1-2周。擴(kuò)增條件針對T細(xì)胞生長進(jìn)行了優(yōu)化，具有細(xì)胞因子支持，如IL-2、IL-7和/或IL-15。雖然擴(kuò)增期的主要目的是增加T細(xì)胞數(shù)量，但它也通過將非T細(xì)胞暴露于不如其他細(xì)胞類型的培養(yǎng)條件來消除非T細(xì)胞，因此即使生產(chǎn)過程從混合PBMC開始，也能產(chǎn)生高度富集的T細(xì)胞產(chǎn)品。除了細(xì)胞因子外，F(xiàn)BS等培養(yǎng)補(bǔ)充劑在支持T細(xì)胞擴(kuò)增方面也起著關(guān)鍵作用，盡管能夠?qū)崿F(xiàn)更精確配方和降低人畜共患病原體風(fēng)險的確定培養(yǎng)基成分正在迅速取代FBS等成分。最后，最近的研究探索了使用各種藥物補(bǔ)充劑來促進(jìn)理想的T細(xì)胞表型并增強(qiáng)所得CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的治療潛力。例如，酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼已用于CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)，以抑制CAR強(qiáng)直信號傳導(dǎo)（即在沒有抗原刺激的情況下的受體信號傳導(dǎo)），從而防止T細(xì)胞過早耗竭并增加CAR-T細(xì)胞功能。該策略用于生產(chǎn)靶向GD2的CAR-T細(xì)胞--已知這些細(xì)胞具有強(qiáng)烈的強(qiáng)直信號并表現(xiàn)出耗竭傾向--用于1期試驗(yàn)，早期結(jié)果顯示多名H3K27M突變彌漫性中線神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者有顯著改善。由于對參加該試驗(yàn)的每位患者進(jìn)行了多劑量的CAR-T細(xì)胞給藥，因此關(guān)于達(dá)沙替尼是否能防止耗竭和/或?qū)崿F(xiàn)持續(xù)T細(xì)胞功能的明確結(jié)論仍然難以捉摸。盡管如此，這個例子證明了藥理學(xué)調(diào)節(jié)CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)過程以產(chǎn)生用于臨床轉(zhuǎn)化的功能性CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的可行性。

       【NO.8】產(chǎn)品放行測試

       利用CAR-T細(xì)胞在2017年治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤方面的突破性成功，全球正在進(jìn)行1000多項(xiàng)活躍的CAR-T細(xì)胞臨床試驗(yàn)，集中在北美和歐亞大陸。臨床研究的熱潮加深了對成功CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品相關(guān)參數(shù)的理解。與任何擬議的療法一樣，尋求臨床評估的CAR-T細(xì)胞必須滿足與安全性、純度、效力、特性和穩(wěn)定性相關(guān)的既定產(chǎn)品特性。所有FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品使用以下指標(biāo)的組合來衡量商品特征：

•        安全性：支原體、無菌、內(nèi)毒素、殘留病毒試劑定量、活力和CAR轉(zhuǎn)基因定量
•        純度：T細(xì)胞純度、活力、殘留試劑定量、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和是否存在污染腫瘤細(xì)胞
•        效價：抗原刺激后轉(zhuǎn)導(dǎo)效果、活力、CAR表達(dá)、細(xì)胞毒性或細(xì)胞因子（如IFN-γ）的產(chǎn)生
•        鑒定：CAR表達(dá)、觀察外觀、清晰度、劑量和活力
•        穩(wěn)定性：配方、運(yùn)輸和儲存。

       FDA最近起草了CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化期望。特別是，早期研究性新藥申請?zhí)峤坏呐畏判袠?biāo)準(zhǔn)不需要經(jīng)過驗(yàn)證的效價測定和規(guī)格，但在生成支持生物制品許可申請的數(shù)據(jù)時必須包括此類測定。

       根據(jù)正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)的積累數(shù)據(jù)，還提出了額外的參數(shù)，以推動未來開發(fā)更具可重復(fù)性、更有效和安全的治療方法。例如，鑒于證據(jù)表明分化較少、記憶樣表型較多的CAR-T產(chǎn)品更有可能實(shí)現(xiàn)持久的腫瘤清除，未來的商業(yè)產(chǎn)品可能會受益于設(shè)置一個功效特征指標(biāo)，該指標(biāo)指定產(chǎn)品中有利T細(xì)胞亞群的比例。然而，更改和收緊產(chǎn)品規(guī)格必須以嚴(yán)格的科學(xué)證據(jù)和基本的生物學(xué)理解為指導(dǎo)，以避免引發(fā)不必要的生產(chǎn)失敗，從而可能減少患者獲得治療的機(jī)會。

       在某些涉及非危及生命的批次放行標(biāo)準(zhǔn)（例如劑量、轉(zhuǎn)導(dǎo)功效、細(xì)胞因子產(chǎn)生水平或CAR表達(dá)）的產(chǎn)品失敗的情況下，在獲得必要的監(jiān)管批準(zhǔn)后，可以向患者施用不合格產(chǎn)品。在擴(kuò)大訪問方案中，患者收到了不合格的商業(yè)和臨床試驗(yàn)產(chǎn)品，并經(jīng)歷了與接受標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品治療的患者相當(dāng)?shù)呐R床結(jié)果。在現(xiàn)實(shí)世界環(huán)境中積累CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的臨床經(jīng)驗(yàn)對于了解哪些產(chǎn)品特性真正影響患者安全性和治療效果非常寶貴，并可能作為進(jìn)一步完善CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品放行測試監(jiān)管指南的指南。

       【NO.9】CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)的下一代策略

       迄今為止討論的生產(chǎn)策略支持了迄今為止多種CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的開發(fā)，并展示了CAR-T細(xì)胞療法克服晚期惡性腫瘤的潛力。然而，F(xiàn)DA批準(zhǔn)后CAR-T細(xì)胞療法的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)也凸顯了傳統(tǒng)細(xì)胞生產(chǎn)工藝的局限性，這些工藝通量低且資源密集，導(dǎo)致患者獲得可能挽救生命的療法的機(jī)會有限。截至2023年初，90%的MM患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展，25%的患者在等待BCMA定向的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品插槽時死于疾病，在接受單采術(shù)之前等待時間從1到10個月不等。單采術(shù)后，細(xì)胞必須經(jīng)過往返生產(chǎn)地點(diǎn)的運(yùn)輸、離體修飾和擴(kuò)增以及嚴(yán)格的質(zhì)量控制測試。大多數(shù)患者需要橋接療法來對抗細(xì)胞生產(chǎn)過程中的進(jìn)一步臨床惡化，這可能導(dǎo)致出現(xiàn)與橋接相關(guān)不良反應(yīng)的患者進(jìn)一步延遲輸注。

       即使在靜脈到靜脈期間沒有醫(yī)療并發(fā)癥的情況下，4-7%的患者也因生產(chǎn)失敗而無法接受他們的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，風(fēng)險因素包括多線治療后患者T細(xì)胞的健康狀況降低和漫長的生產(chǎn)過程本身。產(chǎn)品生產(chǎn)失敗后的治療選擇包括重復(fù)單采術(shù)或過渡到替代療法，盡管這兩種情況下的生存結(jié)果都很差?？偠灾瑢?dǎo)致生命損失的多種延誤來源強(qiáng)調(diào)了及時獲得CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的重要性。在這里，我們討論了正在開發(fā)的下一代策略，以應(yīng)對CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)中的關(guān)鍵挑戰(zhàn)（表2）。

       表2.下一代CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)策略

       9.1加速細(xì)胞生產(chǎn)

       為了應(yīng)對CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)中的這些挑戰(zhàn)，已經(jīng)開發(fā)了新策略來顯著縮短細(xì)胞生產(chǎn)的持續(xù)時間，從而降低生產(chǎn)成本，生產(chǎn)造失敗的可能性和靜脈到靜脈的時間。這些下一代生產(chǎn)工藝可以在短短24小時內(nèi)形成最終產(chǎn)品配方（圖1），從而有可能顯著加快患者獲得治療的機(jī)會。大部分時間節(jié)省是由于離體擴(kuò)增期的顯著縮短，從而限制了可以實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞計數(shù)的倍數(shù)增加。然而，離體細(xì)胞分裂次數(shù)的減少也可能導(dǎo)致T細(xì)胞群分化程度降低，輸注后具有更大的長期增殖潛力。事實(shí)上，早期結(jié)果表明，在早期時間點(diǎn)收獲的產(chǎn)物表現(xiàn)出更大比例的TCM細(xì)胞（CD45RO+CD62L+）和TN/TSCM細(xì)胞（CD45RO-/CCR7+），據(jù)報道，它們表現(xiàn)出治療上有利的表型和功能。

       使用加速生產(chǎn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的一個例子是使用"T-Charge"平臺生產(chǎn)的CD19定向YTB323細(xì)胞，該平臺需要<2天的離體培養(yǎng)。據(jù)報道，與使用傳統(tǒng)CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的等效產(chǎn)品（tisa-cel）。值得注意的是，2期試驗(yàn)的初步結(jié)果表明，YTB323在復(fù)發(fā)/難治性彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）患者中可以產(chǎn)生與tisa-cel相當(dāng)?shù)寞熜В珓┝康?5倍，這表明減少的離體培養(yǎng)時間可能產(chǎn)生了功能優(yōu)越的產(chǎn)品。另一個例子是，在復(fù)發(fā)/難治性MM患者的1期試驗(yàn)中，使用相同的T-Charge平臺生產(chǎn)的BCMA定向PHE885細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了98%的總體緩解率。值得注意的是，93%（13/14）的患者在輸注后6個月可檢測到CAR-T細(xì)胞，在71%（5/7）的患者在12個月時可檢測到CAR-T細(xì)胞，表明體內(nèi)T細(xì)胞具有強(qiáng)大的持久性。

       另一個名為FasTCAR-T的加速生產(chǎn)平臺已被用于為B-ALL患者生成"CD19F-CAR-T"細(xì)胞，其中92%（23/25）的患者實(shí)現(xiàn)了最小殘留病陰性完全緩解。該試驗(yàn)中的大多數(shù)（20/25）患者繼續(xù)接受同種異體造血干細(xì)胞移植，因此無法評估對CAR-T細(xì)胞治療反應(yīng)的長期持久性。隨著來自多項(xiàng)試驗(yàn)的臨床數(shù)據(jù)不斷成熟，通過不同生產(chǎn)平臺產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品誘導(dǎo)的反應(yīng)的相對持久性將是一個重要的關(guān)注點(diǎn)。

       與加速細(xì)胞生產(chǎn)過程相關(guān)的理論問題是，在離體激活后不久冷凍保存的CAR-T細(xì)胞可能表現(xiàn)出過度刺激的表型。此外，特別是在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的情況下，來自高度簡化的生產(chǎn)工藝的產(chǎn)品增加了包含腫瘤細(xì)胞的可能性，否則這些細(xì)胞在針對T細(xì)胞生長優(yōu)化的條件下，在延長的離體培養(yǎng)期間會被耗盡。然而，現(xiàn)有的臨床數(shù)據(jù)表明，通過這些縮短方案生產(chǎn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的安全性在臨床上仍然是可控的。YTB323治療DLBCL的1期研究結(jié)果顯示，33%（15/45）的患者經(jīng)歷過CRS，伴有1例4級事件，11%（5/45）出現(xiàn)免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（ICANS），伴有2例3級事件。在B-ALL患者中，CD19F-CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出更大的毒性，CRS的發(fā)生率增加了兩倍（總體為96%，≥級為24%），ICANS的發(fā)生率增加了一倍（28%，均為≥3級）。25名患者中有21名在CRS發(fā)作期間需要介入性皮質(zhì)類固醇，盡管治療并未消融CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增峰值。來自正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)的額外數(shù)據(jù)將有助于建立我們對通過不同平臺生產(chǎn)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品之間生物學(xué)差異的理解。最后，需要注意的是，關(guān)于產(chǎn)品放行測試的監(jiān)管要求仍然適用于采用加速工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品，并且在估計靜脈到靜脈的時間時，仍需要考慮此類放行測試所需的時間。

       9.2流程自動化

       改進(jìn)商業(yè)CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)的另一種途徑涉及生產(chǎn)過程的自動化，這有可能降低生產(chǎn)成本、人為錯誤導(dǎo)致生產(chǎn)失敗的可能性以及接觸點(diǎn)的污染。在某些司法管轄區(qū)（例如美國），一些自動化系統(tǒng)被視為全封閉系統(tǒng)，允許在符合良好生產(chǎn)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)施外部運(yùn)行。此外，自動化可以顯著減少生產(chǎn)人員所需的數(shù)量和經(jīng)驗(yàn)水平。反過來，這些因素支持了現(xiàn)場生產(chǎn)的可能性，從而為患者提供新鮮、非冷凍保存的產(chǎn)品。在一項(xiàng)針對非霍奇金淋巴瘤患者的1期試驗(yàn)中，患者接受了CD19/CD20雙特異性CAR-T細(xì)胞，這些細(xì)胞要么新鮮給藥，要么從凍存的等分試樣中解凍，早期數(shù)據(jù)顯示新鮮CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品具有更高的活力（93%新鮮對63%凍存）。該試驗(yàn)的后續(xù)報告證實(shí)，與使用冷凍保存的CAR-T細(xì)胞治療的患者相比，接受新鮮CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品治療的患者的完全緩解率要高得多（80%新鮮對29%冷凍保存）以及更大的CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增和持久性。盡管細(xì)胞冷凍保存程序的改進(jìn)仍有可能減少新鮮和冷凍保存的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品之間觀察到的功效差異，但這些結(jié)果突出了現(xiàn)場細(xì)胞生產(chǎn)的潛在優(yōu)勢。然而，在確保產(chǎn)品質(zhì)量始終如一的同時，將這種做法擴(kuò)展到大量醫(yī)療中心仍然是一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)。重要的是，需要進(jìn)行幾項(xiàng)監(jiān)管改革才能允許即時CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)，而全球司法管轄區(qū)之間的差異代表了現(xiàn)場細(xì)胞生產(chǎn)實(shí)際實(shí)施的重大障礙。此外，使用新鮮細(xì)胞產(chǎn)品會妨礙完成需要較長潛伏期的放行測試，因此需要依賴過程中的樣本測試以及應(yīng)急臨床管理計劃，以應(yīng)對在細(xì)胞產(chǎn)品輸注后收到無菌或其他測試結(jié)果失敗的情況。此外，新鮮產(chǎn)品的管理帶來了重大的物流挑戰(zhàn)，因?yàn)樗枰?xì)胞生產(chǎn)和患者接受細(xì)胞輸注的準(zhǔn)備之間密切的時間協(xié)調(diào)。最后，當(dāng)需要根據(jù)患者調(diào)整最佳過程參數(shù)設(shè)置時，自動化系統(tǒng)的高度標(biāo)準(zhǔn)化性質(zhì)可能會帶來挑戰(zhàn)。例如，來自不同患者的細(xì)胞可能具有截然不同的擴(kuò)增速率，因此每天在培養(yǎng)物中維持適當(dāng)細(xì)胞密度所需的培養(yǎng)基量可能因生產(chǎn)活動而異。為了實(shí)現(xiàn)最佳結(jié)果，需要配備儀器來感應(yīng)關(guān)鍵參數(shù)并做出相應(yīng)的響應(yīng)。

       9.3體內(nèi)細(xì)胞生產(chǎn)

       展望未來，下一代生產(chǎn)工藝可能會完全消除離體細(xì)胞作和擴(kuò)增，而是在體內(nèi)產(chǎn)生治療性細(xì)胞群。幾項(xiàng)臨床前研究表明，能夠使用慢病毒或腺相關(guān)病毒在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞。此外，脂質(zhì)納米顆粒（LNP）和聚合物納米載體已被證明可以在體內(nèi)將核酸有效載荷遞送到T細(xì)胞。為了實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞靶向，病毒顆粒、LNP和納米載體通常用單鏈可變片段或其他靶向CD3、CD4或CD8的結(jié)合結(jié)構(gòu)域修飾。然而，T細(xì)胞靶向的特異性可能不需要是絕 對的，人們可以考慮同時生成CAR-T細(xì)胞、CAR-自然殺傷細(xì)胞和CAR-巨噬細(xì)胞的潛在優(yōu)勢。然而，不將轉(zhuǎn)基因遞送到惡性細(xì)胞中仍然至關(guān)重要，因?yàn)檫@樣的整合事件可能導(dǎo)致CAR蛋白掩蓋靶抗原并保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受表達(dá)CAR的效應(yīng)細(xì)胞的檢測。此外，在可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因整合的病毒載體的情況下，脫靶基因遞送增加了遺傳毒性風(fēng)險。在實(shí)踐中，專門針對T細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因遞送載體和促進(jìn)高效轉(zhuǎn)基因整合的策略，而無需外部T細(xì)胞激活，對于產(chǎn)生能夠?qū)崿F(xiàn)持久抗腫瘤療效的有效劑量的CAR-T細(xì)胞可能是必要的。最后，在體內(nèi)CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)平臺的臨床轉(zhuǎn)化之前，需要進(jìn)行深入的藥代動力學(xué)和安全性驗(yàn)證。盡管仍然存在許多障礙，但繞過離體細(xì)胞生產(chǎn)的能力有可能顯著降低成本，并增加需要這種治療選擇的患者獲得CAR-T細(xì)胞療法的機(jī)會。

       【NO.10】總結(jié)

       CAR-T細(xì)胞療法已成為血液系統(tǒng)惡性腫瘤越來越重要的治療選擇，臨床試驗(yàn)不斷將CAR-T細(xì)胞療法的應(yīng)用擴(kuò)展到實(shí)體瘤和自身免疫性疾病的治療。因此，能夠高效可靠地生產(chǎn)高質(zhì)量細(xì)胞產(chǎn)品的CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)工藝對于支持及時、安全和有效的患者護(hù)理至關(guān)重要。積累的臨床經(jīng)驗(yàn)、真實(shí)世界的生產(chǎn)數(shù)據(jù)收集、自動化系統(tǒng)工程的進(jìn)步以及對T細(xì)胞生物學(xué)的基本理解都在自體CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)工藝的持續(xù)改進(jìn)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。此外，同種異體細(xì)胞療法的快速發(fā)展前景涉及額外的免疫效應(yīng)細(xì)胞類型以及干細(xì)胞群產(chǎn)生的T細(xì)胞，在未來幾年將繼續(xù)成為有趣的科學(xué)問題和實(shí)際工程挑戰(zhàn)的來源。