摘要：生物制藥產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒是可引起免疫原性的雜質(zhì)。蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒在制造和儲存過程中形成，應對其進行表征以優(yōu)化制造過程并建立控制策略。一直關(guān)注到有關(guān)這些顆粒的評估和控制的幾個問題。然而，對于并行利用分析技術(shù)來建立此類蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的控制策略，其尺寸從幾納米到幾百微米不等，仍未達成共識。因此，這項研究中通過問卷調(diào)查了日本生物制藥公司，其中包括有關(guān)在各個開發(fā)階段用于建立蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆?？刂撇呗缘姆治黾夹g(shù)的問題?？偨Y(jié)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)從早期開發(fā)和配方優(yōu)化階段到商業(yè)生產(chǎn)，尺寸排阻色譜、光遮光和目視檢查一直被使用。除了光遮蔽法外，流動成像（FI）是亞可見光顆粒表征最常用的技術(shù);因此，記錄了使用FI建立控制策略?？偨Y(jié)了基于藥物開發(fā)生命周期建立蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆?？刂撇呗缘慕ㄗh。

       【NO.1】介紹

       生物制藥原料藥（DS）和藥品（DP）中的蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒被認為是需要充分評估和控制的雜質(zhì)，因為它們可能引發(fā)免疫原性。這些雜質(zhì)的表征對于建立控制策略非常重要。應同時使用多種分析技術(shù)，以獲得生物制藥中蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的全部特性，其尺寸從幾納米到數(shù)百微米不等。因為每種分析方法具有不同的分析性能和特征，例如直徑度量（費雷特直徑、等效圓直徑和流體動力學直徑等）、測量直徑范圍、定量或定性以及藥典或非藥典的差異。此外，聚集體和不溶性顆粒水平所需的分析性能和特性可能因從早期開發(fā)到商業(yè)生產(chǎn)的生命周期階段而異。因此，預計分析技術(shù)將分階段應用來評估和控制產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒。此外，在制造過程和儲存過程中出現(xiàn)或形成的蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒可能在形態(tài)和來源上表現(xiàn)出明顯的特征。不溶性顆粒按其來源分為三類：

       （1）外源性顆粒是外來材料，預計不會出現(xiàn)在制造過程中;

       （2）源自制造過程和初級容器的本征顆粒;

       （3）制造儀器和蛋白質(zhì)顆粒的預期固有顆粒。

       蛋白質(zhì)聚集體可分為解離或不可逆，或天然或變性狀態(tài)。蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的這些表征有望用于風險評估。它們可用于建立控制策略，例如識別引發(fā)聚集體形成的因素和選擇制造工藝以減少蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒。

       然而，對于并行使用多種分析技術(shù)來建立蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的控制策略，目前尚未達成共識。因此，各個公司必須考慮應將哪些類型的分析技術(shù)組合為分析策略，并應制定制造過程中蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的控制策略?；谶@種情況，有必要就聚集體和不溶性顆粒的控制策略組織共識。

       在這項研究中調(diào)查了日本生物制藥公司，這些公司同時使用多種分析技術(shù)來建立蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒在其開發(fā)和生命周期的不同階段的控制策略。根據(jù)從參與機構(gòu)收集的調(diào)查結(jié)果，該小組討論了使用FI來建立控制策略。該小組還總結(jié)了在為蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒制定控制策略時需要考慮的要點。

       【NO.2】調(diào)查結(jié)果討論

       使用了某些分析技術(shù)，例如SEC、LO和FI，而其他技術(shù)則未使用。對于集成技術(shù)，如DLS、SLS和LD，一些大顆粒會影響粒度分布，并且很難將測量信號與前面討論的顆粒濃度定量關(guān)聯(lián)起來。對于單顆粒技術(shù)，如電感應區(qū)（ESZ）、NTA和RMM，可以適當測量的濃度范圍很窄，并且實際測量的體積與制劑的總體積相比很小，導致統(tǒng)計采樣不足。關(guān)于NTA和RMM，基于對商業(yè)蛋白質(zhì)產(chǎn)品中亞微米顆粒水平的多公司評估，報告了實驗室間的顯著差異。此外，從這些技術(shù)獲得的結(jié)果很難解釋。也很難在這些結(jié)果與SEC、LO和FI的結(jié)果之間建立明確的相關(guān)性。這可能會使建立可見和不可見顆粒的控制策略變得困難。為了解決這些問題，有必要開發(fā)能夠以高精度、精密度和更寬動態(tài)范圍定量測量亞微米范圍顆粒的技術(shù)，并開發(fā)一種將結(jié)果與SEC、LO和FI聯(lián)系起來的定量模型。

       【NO.3】建立蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒控制策略的注意事項

       為了對使用多種分析技術(shù)建立蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的控制策略達成共識，我們的建議總結(jié)如下。它從介紹性部分開始，然后是選擇每個階段要使用的分析技術(shù)并根據(jù)開發(fā)階段建立控制策略的指南。如上所述，從討論中摘錄了使用FI的考慮要點。還參考了當前的行業(yè)觀點、監(jiān)管指南和藥典，總結(jié)了關(guān)于可見顆?？刂频慕ㄗh。

       使用基于風險的方法建立控制聚集體和不溶性顆粒的策略，以確保產(chǎn)品的安全性、有效性和免疫原性（圖4）。風險評估以開發(fā)過程中獲得的知識為依據(jù)，包括聚集體和不溶性顆粒的綜合表征。建議使用各種分析技術(shù)來全面表征蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒。正交技術(shù)有助于評估顆粒性質(zhì)（外源、內(nèi)征或內(nèi)在）、顆粒數(shù)量、顆粒粒度分布以及區(qū)分顆粒的其他特性。了解蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的特性可用于確定潛在的形成機制。這些知識還可用于指導配方或制造工藝開發(fā)過程中的配方和工藝參數(shù)的選擇，從而減少最終藥品中的蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒。

       圖4 通過基于風險的方法建立聚集體和不溶性顆?？刂撇呗缘挠媱?/p>

       3.1 開發(fā)階段（第1-3期）

       SEC、LO和目視檢查等常用分析技術(shù)用于臨床試驗中使用的原料藥和產(chǎn)品的放行或穩(wěn)定性測試。如果需要，F(xiàn)I可用于產(chǎn)品的脫?；蚍€(wěn)定性。對于原料藥的額外監(jiān)測和表征，可以使用使用MALS作為SEC檢測器的SEC-MALS、AUC和DLS。FI可用于藥品的額外監(jiān)測和表征。LO和FI用于監(jiān)測和分析>10μm和<10μm顆粒的特性。

       應考慮使用其他技術(shù)來解決隨著開發(fā)進程而出現(xiàn)的問題。例如，qLD、NTA、RMM、ESZ、靜態(tài)光散射（SLS）、LM、BMI、FT-IR和拉曼光譜等技術(shù)可能有助于了解聚集體和不溶性顆粒，包括亞可見和可見顆粒的數(shù)量和分布、它們的來源以及與制造過程的相關(guān)性。更先進的分析技術(shù)，如全息視頻顯微鏡或機器學習工具，可以用作SEC、LO和FI的正交技術(shù)。使用多種技術(shù)，可以闡明聚集體和顆粒形成背后的因素和機制，例如在填充過程中從泵產(chǎn)生的金屬顆粒充當聚集體形成的核，以及用作表面活性劑的泊洛沙姆的材料屬性（疏水性）參與可見顆粒的形成。因此，通過結(jié)合多種技術(shù)獲得的信息最終將有助于建立風險緩解措施，以減少制造過程中顆粒的產(chǎn)生。當難以評估發(fā)育過程中檢測到的蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的安全風險時，除了顆粒組成、尺寸分布和數(shù)量的分析結(jié)果外，生物活性（例如體外免疫細胞活化）的評估可能為建立控制策略提供有用的信息。

       3.2 配方開發(fā)和使用中/相容性研究

       為了靈敏地檢測配方的差異和應力引起的變化，與其他步驟相比，評估<10μm顆粒更為重要。特別是，在檢查配方時，選擇能夠以高通量分析少量樣品的技術(shù)或儀器。除了SEC、LO和FI之外，DLS是另一種用于配方開發(fā)的技術(shù)。qLD、NTA、RMM、SLS和BMI也可用于評估亞微米到亞可見的顆粒。雖然不包括在問卷中，但濁度和粘度被用作配方開發(fā)的指標。

       3.3 商業(yè)生產(chǎn)

       放行和穩(wěn)定性測試需要成熟、授權(quán)且符合法規(guī)的技術(shù)或程序。作為這些測試的一部分，使用SEC測試原料藥的純度。對于藥品，除了SEC之外，還通過LO進行目視檢查和不可見顆粒測試?？刂撇呗赃€包括對開發(fā)過程中確定的相關(guān)原材料（添加劑，如表面活性劑和容器密封系統(tǒng)）和制造工藝參數(shù)（原料藥的病毒滅活和純化過程以及藥品的灌裝過程）的控制。此外，在監(jiān)測原料藥或藥品的聚集體和不溶性顆粒時，應建立行動限值，以表明是否需要進一步研究。對于可能在開發(fā)過程中或商業(yè)生產(chǎn)開始后進行的可比性研究，如上所述，SEC、LO和目視檢查將是基礎(chǔ)，也使用FI和DLS。

       3.4 根本原因分析

       如果在目視檢查過程中檢測到可見顆粒，則應進行根本原因分析。為了進行根本原因分析，應確定顆粒中的元素，并立即確定顆粒來源。常用的技術(shù)包括FT-IR、拉曼顯微鏡、EM和電子顯微鏡能量色散X射線（EM-EDX）。

       3.5 利用FI建立控制策略

       FI提供有關(guān)亞可見顆粒的數(shù)量（濃度）及其形態(tài)參數(shù)的信息。因此，它用于定量和定性評估不可見顆粒?？紤]到這些特性，F(xiàn)I可用于早期開發(fā)期間或1-3階段的配方開發(fā)、穩(wěn)定性測試和監(jiān)測。當檢測到顆粒數(shù)量突然增加等趨勢時，F(xiàn)I也可用于確定原因或故障排除，例如，通過從形態(tài)參數(shù)推斷顆粒增加的來源（蛋白質(zhì)顆粒、硅油或空氣）。此外，所得顆粒圖像可用于結(jié)合機器學習來估計導致蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的制造過程或應力類型。

       一般藥典測試方法（USP788、787、Ph.Eur.2.9.19、JP6.07、6.17）中未包含F(xiàn)I，并且存在輕微的穩(wěn)定性問題。因此，它們通常不用作商業(yè)生產(chǎn)中的放行或穩(wěn)定性測試。確定開發(fā)過程中特性測試的結(jié)果（包括FI）與放行測試結(jié)果（如LO）之間的相關(guān)性，可能有助于制定合理的控制策略。例如，如果在開發(fā)階段同時使用LO和FI的批次分析結(jié)果是相關(guān)的，則在商業(yè)生產(chǎn)中可能僅使用LO來捕獲趨勢。但是，如果FI可以檢測到LO無法捕獲的波動，那么在商業(yè)生產(chǎn)中應用FI進行監(jiān)測可能是一種有效的降低風險措施。

       3.6 可見粒子控制的注意事項

       由于可見顆粒的無意污染可能會被召回，因此有必要制定控制策略以最大限度地減少可見顆粒的發(fā)生和影響。除了根據(jù)GMP進行環(huán)境控制外，產(chǎn)品和制造工藝的適當設(shè)計也很重要。在整個制造過程中控制可見顆粒包括建立包裝材料的驗收標準、制備藥物溶液、灌裝作、對灌裝產(chǎn)品進行100%檢查以及最終決定運輸。此外，應考慮目視檢查的生命周期，包括檢查資格、檢查員培訓、缺陷表征以及通過趨勢分析進行持續(xù)改進。

       目視檢查從填充后的100%檢查開始。應設(shè)置代表性拒絕率限值，以識別不符合標準的批次?？梢詾槊總€缺陷類別（關(guān)鍵、主要和次要）和可見粒子源設(shè)置限值。經(jīng)過100%檢查后，應從檢驗員判斷適合目視檢查的容器中選擇統(tǒng)計上合理的樣品數(shù)量。樣本量和缺陷容器的數(shù)量可以根據(jù)AQL確定。通常，分別為高風險和低風險缺陷設(shè)置低（嚴格）和高（寬松）AQL。一旦超過檢驗限值或AQL允許的缺陷數(shù)量，應啟動調(diào)查。調(diào)查可能包括重新測試、識別和表征檢測到的可見顆粒，以及根本原因分析。

       可以根據(jù)患者影響的風險和法規(guī)遵從性對缺陷進行分類。嚴重缺陷可能導致患者發(fā)生嚴重不良事件或死亡，例如與無菌產(chǎn)品的容器完整性不相容導致微生物污染的風險。重大缺陷存在暫時性產(chǎn)品故障或醫(yī)學上可逆反應的風險，但引起嚴重副作用的可能性很小。輕微缺陷不會影響產(chǎn)品性能或合規(guī)性，而只影響產(chǎn)品的外觀。

       根據(jù)它們的來源，可見粒子可以分為外源、內(nèi)在或內(nèi)在。外源性顆粒源于正常的制造過程之外。在為外源性顆粒設(shè)定限值時，應考慮外源性顆粒含量高的批次可能造成較高的微生物污染風險，并表明缺乏GMP控制。由于本征顆粒來自制造過程中使用的原材料、設(shè)備和內(nèi)包裝，因此應在早期開發(fā)階段確定其原因，并采取措施防止產(chǎn)品有缺陷。由于本征顆粒包括蛋白質(zhì)顆粒和來自最終藥品的其他顆粒，因此在開發(fā)過程中應評估批次內(nèi)的顆粒分布。

       在檢查過程中，可靠地去除了帶有外源性和內(nèi)源性顆粒的容器，原則上也應去除內(nèi)在顆粒。但是，如果滿足商品外觀規(guī)格，該測試可能會允許接受固有顆粒。此外，內(nèi)源性顆粒（如硅油液滴和蛋白質(zhì)顆粒）可能允許出現(xiàn)在可檢測到的產(chǎn)品中。是否應允許可見顆粒必須根據(jù)其識別和表征、導致其發(fā)生的因素的調(diào)查以及安全風險評估來確定。如果測試允許可見顆粒，則必須制定控制策略，包括釋放測試，以控制可見顆粒?？梢钥煽繙y定的顆粒大小取決于配方、容器和顆粒特性。建議準備適當?shù)臉藴势泛拖蘖繕悠罚⑹褂盟鼈儊砼嘤枡z查員區(qū)分可接受和有缺陷的單位容器。此外，在穩(wěn)定性測試期間，應監(jiān)測任何可能隨時間產(chǎn)生大于可接受標準的顆粒或數(shù)量大于驗收標準的顆粒的變化。

       【NO.4】結(jié)論

       根據(jù)調(diào)查結(jié)果，本文討論了評估和控制聚集體和不溶性顆粒的方法。SEC、LO和目視檢查從早期開發(fā)和配方考慮到商業(yè)生產(chǎn)都得到一致使用。除了這些分析方法外，F(xiàn)I是亞可見顆粒表征最常用的技術(shù)。然而，由于在日本批準的大多數(shù)生物制藥都是許可產(chǎn)品，很少有產(chǎn)品是獨立開發(fā)的，因此關(guān)于如何利用FI存在各種想法。因此，本研究建立了目前對使用FI建立蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆?？刂撇呗缘睦斫?。隨著技術(shù)的進步，需要進一步的研究和討論來構(gòu)建新的方法。在商業(yè)制造中，當在目視檢查過程中檢測到顆粒時，需要進行根本原因分析。然而，許多公司將檢測到的顆粒物的鑒定外包出去，需要注意的技術(shù)要點可能不會在相關(guān)方之間共享。盡管蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒的表征有助于質(zhì)量控制策略的開發(fā)，但無法定量評估亞微米顆粒（從大約100nm到1μm）被認為是分析技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)。更先進技術(shù)的開發(fā)和應用可能會解決這些挑戰(zhàn)。此外，應確保新分析技術(shù)的有效性以促進其使用。除了開發(fā)新技術(shù)和改進設(shè)備外，還需要開展促進測量協(xié)議標準化的合作活動，包括應用新的參考物質(zhì)，這將是有效的。

       除了調(diào)查結(jié)果外，關(guān)于建立蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆?？刂撇呗缘慕ㄗh也總結(jié)在要考慮的要點部分中。全球尚無全面解決蛋白質(zhì)聚集體和不溶性顆粒問題的監(jiān)管指南。我們希望我們的建議將有助于促進其他生物制藥的發(fā)展并確保其質(zhì)量和安全。