傳統(tǒng)的賴(lài)氨酸偶聯(lián)ADC藥物采用非定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)，代表性藥物有Kadcyla、Mylotarg、Besponsa。天然存在于賴(lài)氨酸側(cè)鏈中的氨基，是與單抗偶聯(lián)最方便的官能團(tuán)，其不需要預(yù)先的化學(xué)修飾步驟。雖然由于其高的pKa(~10.5)，大部分蛋白質(zhì)在中性pH下被質(zhì)子化，但蛋白質(zhì)中仍有一小部分氨基將以中性、未質(zhì)子化的形式存在。賴(lài)氨酸側(cè)鏈中的氨基在親核性方面僅次于硫醇基團(tuán)，但明顯領(lǐng)先于其他的氨基酸的側(cè)鏈(如精氨酸、絲氨酸、色氨酸、蛋氨酸)。然而由于賴(lài)氨酸的大量存在，有限數(shù)量的選擇性偶聯(lián)是非常具有挑戰(zhàn)性的，因此賴(lài)氨酸偶聯(lián)的ADC通常顯示出廣泛的DAR分布，例如lgG分子具有超過(guò)80個(gè)賴(lài)氨酸殘基，其中溶劑可及性高的位點(diǎn)超過(guò)20個(gè)。
Kadcyla 結(jié)構(gòu)
但是傳統(tǒng)的賴(lài)氨酸偶聯(lián)ADC藥物采用非定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)，因此產(chǎn)品均一性較差，這種DAR與偶聯(lián)位點(diǎn)的變化對(duì)臨床效果產(chǎn)生不良影響。為了解決這個(gè)問(wèn)題，科學(xué)家提出較多賴(lài)氨酸定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)，如選擇性修飾活性最強(qiáng)的賴(lài)氨酸，通過(guò)酶實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾等。
pClick技術(shù)
pClick技術(shù)是無(wú)需抗體工程或復(fù)雜的反應(yīng)條件的便捷方法。這種親和肽方案由Han團(tuán)隊(duì)首 創(chuàng)，他們選用來(lái)自金黃色葡萄球菌的蛋白A的B結(jié)構(gòu)域(FB蛋白)合成含非天然氨基酸的肽，由FB蛋白實(shí)現(xiàn)有利定位和接近，選擇性非天然氨基酸與特定賴(lài)氨酸反應(yīng)。當(dāng)選用曲妥珠單抗(Tras)和FB-E25FPheK(4-氟苯基氨基甲酸酯賴(lài)氨酸)突變體作為模型底物時(shí)，研究人員證明過(guò)量的FB-E25FPheK突變體進(jìn)行48 h的偶聯(lián)反應(yīng)可使Tras-FB偶聯(lián)物的偶聯(lián)產(chǎn)率>95%而單一修飾位點(diǎn)K337。
AJICAP技術(shù)
AJICAP技術(shù)是一類(lèi)使用Fc(抗體可結(jié)晶片段)親和試劑對(duì)天然抗體進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾的方法。
第1代AJICAP利用Fc親和肽試劑實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)后，用三(2-羧乙基)膦[tris (2-chloroethyl) phosphate，TCEP]還原以在特定賴(lài)氨酸上安裝硫醇基團(tuán)，而后用去氫抗壞血酸氧化重建因還原而裂解的抗體鏈間二硫鍵，由此成功地修飾了位點(diǎn)K248。
但再氧化步驟往往導(dǎo)致二硫鍵被擾亂與聚集性問(wèn)題，所以第2代AJICAP避免了氧化還原處理，直接采用連接子裂解反應(yīng)，除與K248成功偶聯(lián)外，使用具有適當(dāng)間隔子的恰當(dāng)Fc親和肽試劑還能合成與K288偶聯(lián)的ADC。
基于此技術(shù)，韓國(guó)公司Abtis發(fā)展的一種ADC定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)-AbClick?。該技術(shù)平臺(tái)通過(guò)親和肽輔助，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)高效的抗體-藥物偶聯(lián)，在天然抗體的248位置的賴(lài)氨酸進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)。
（圖片來(lái)源：AbTis官網(wǎng)）
吲哚-3-丁酸 (indole-3-butyric acid，IBA)衍生肽鄰近誘導(dǎo)技術(shù)
Rajagopalan團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，抗體的輕鏈與重鏈之間存在著高度保守的核苷酸結(jié)合域(nucleotide binding domain，NBD)，這種存在于所有免疫球蛋白Fab(抗原結(jié)合片段)組的特性為其廣泛的應(yīng)用創(chuàng)造了可能。通過(guò)建模分析與計(jì)算機(jī)篩選，Bilgicer團(tuán)隊(duì)確定IBA對(duì)該NBD有高親和力，Kd(dissociation constant)值范圍為1~8 μmol·L?1，具體取決于抗體。于是他們?cè)O(shè)計(jì)了依靠IBA偶聯(lián)抗體核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的紫外光交聯(lián)方法，并發(fā)現(xiàn)在紫外光不至損傷抗體活性的情況下最多能實(shí)現(xiàn)1.41個(gè)偶聯(lián)。
為了避免紫外光對(duì)抗體的影響，Lam團(tuán)隊(duì)對(duì)親和試劑進(jìn)行了優(yōu)化。他們發(fā)現(xiàn)帶負(fù)電荷的氨基酸可增強(qiáng)對(duì)NBD的親和力和交聯(lián)能力，于是采用OBOC組合肽庫(kù)和新穎的篩選策略確定親和元素天冬氨酸和絲氨酸殘基(DS肽)，再結(jié)合1,5-二氟-2,4-二硝基苯以實(shí)現(xiàn)對(duì)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的不可逆連接。
關(guān)鍵點(diǎn)定向修飾技術(shù)(linchpin-directed modification，LDM)
關(guān)鍵點(diǎn)定向修飾技術(shù)是Rai團(tuán)隊(duì)首 創(chuàng)的，他們通過(guò)可逆的分子間反應(yīng)將"關(guān)鍵點(diǎn)"放置在所有可及的特定氨基酸殘基上，再使另一官能團(tuán)不可逆地選擇性修飾鄰近的特定基團(tuán)，最后解離關(guān)鍵修飾，完成對(duì)蛋白質(zhì)的特異性修飾。其中，他們使用間隔子調(diào)整以精確匹配鄰近修飾的相對(duì)方向。最初，研究人員設(shè)想通過(guò)關(guān)鍵修飾高豐度的賴(lài)氨酸來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)低豐度氨基酸的特異性修飾，并成功獲得了選擇性良好、對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制效果好的DAR 4的ADC。但這樣的策略很難在復(fù)雜混合物中精確修飾單個(gè)蛋白質(zhì)，于是研究人員設(shè)想通過(guò)關(guān)鍵修飾半胱氨酸實(shí)現(xiàn)對(duì)鄰近賴(lài)氨酸特異性修飾(LDMC-K)。他們首先用TCEP處理單克隆抗體以減少二硫醚并引入游離半胱氨酸，再利用LDMC-K技術(shù)得到定點(diǎn)修飾的醛抗體偶聯(lián)物(antibody-aldehyde conjugate，AAC)，用美登素DM1的羥胺衍生物處理得到ADC。
賴(lài)氨酸特異性試劑
Bernardes等人也報(bào)道了特定部位的賴(lài)氨酸?；磻?yīng)。使用從計(jì)算機(jī)輔助預(yù)測(cè)的具有最低pKA的抗體賴(lài)氨酸的試劑，在略堿性pH的?；磻?yīng)將在動(dòng)力學(xué)上有利的。研究發(fā)現(xiàn)磺?；┧狨H使用單摩爾當(dāng)量(37℃，pH 8.0)就能快速進(jìn)行反應(yīng)，使得曲妥珠單抗輕鏈Lys207的定量和不可逆修飾，并完全保留天然二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能。
K-lock（K188技術(shù)）
K-lock定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)是由Concortis Biosystems公司（被Sorrento Therapeutics收購(gòu)，Sorrento 于2023年2月申請(qǐng)破產(chǎn)）開(kāi)發(fā)的一種用于抗體藥物偶聯(lián)物制備的創(chuàng)新技術(shù)。以下是關(guān)于K-lock技術(shù)的一些關(guān)鍵點(diǎn)：
K188的獨(dú)特微環(huán)境：K188附近存在組氨酸（Histidine, H）和天冬氨酸（Aspartic acid, D）殘基，這些殘基改變了K188的pKa值，使其ε-氨基更容易被修飾。
氟苯酯衍生物的特異性：與傳統(tǒng)的N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS）試劑不同，氟苯酯衍生物對(duì)K188的微環(huán)境具有高度選擇性。只有在K188存在時(shí)，氟苯酯衍生物才會(huì)發(fā)生加成反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)。
K-lock技術(shù)已被用于多個(gè)ADC項(xiàng)目，比如昭華生物與杭州愛(ài)科瑞思合作的HER2靶向ADC（ZV0203）。
ZV0203結(jié)構(gòu)
科倫博泰引進(jìn)Sorrento技術(shù)開(kāi)發(fā)的HER2靶向ADC藥物A166。
A166結(jié)構(gòu)
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