摘要：在生物制藥產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的今天，重組治療性蛋白（如抗體）的高效生產(chǎn)成為關(guān)鍵。哺乳動物細(xì)胞因能模擬人類細(xì)胞的翻譯后修飾（如糖基化），成為生產(chǎn)這類蛋白的核心 "細(xì)胞工廠"，其中中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞和人胚腎 293（HEK293）細(xì)胞應(yīng)用最廣。與需要長期篩選的穩(wěn)定基因表達(dá)（SGE）系統(tǒng)不同，瞬時基因表達(dá)（TGE）系統(tǒng)憑借 "短周期、易操作" 的優(yōu)勢，成為生物藥早期研發(fā)的重要工具。本文系統(tǒng)梳理了 TGE 系統(tǒng)的組成，詳解了細(xì)胞系改造、表達(dá)載體工程、培養(yǎng)基優(yōu)化、轉(zhuǎn)染條件篩選、輔助基因共表達(dá)等關(guān)鍵優(yōu)化策略，結(jié)合最新研究數(shù)據(jù)說明如何提升重組蛋白的產(chǎn)量與質(zhì)量，為產(chǎn)業(yè)界提供從實(shí)驗(yàn)室到規(guī)?；a(chǎn)的實(shí)用參考。

       一、引言：生物制藥的 "細(xì)胞工廠" 與瞬時表達(dá)的獨(dú)特價值

       全球生物制藥市場規(guī)模正以驚人速度擴(kuò)張，預(yù)計(jì) 2024 年將達(dá)到 3.89 億美元，其中重組治療性蛋白是核心組成部分。這類蛋白的生產(chǎn)依賴于合適的表達(dá)系統(tǒng)，細(xì)菌、酵母、植物雖各有應(yīng)用，但哺乳動物細(xì)胞因能進(jìn)行復(fù)雜的翻譯后修飾（PTMs）-- 尤其是與人類細(xì)胞相似的糖基化，成為生產(chǎn)抗體等復(fù)雜蛋白的首選。

       在眾多哺乳動物細(xì)胞中，CHO 細(xì)胞堪稱 "王牌選手"：全球 89% 的哺乳動物細(xì)胞來源生物藥由它生產(chǎn)。這得益于它能合成復(fù)雜結(jié)構(gòu)蛋白、可大規(guī)模培養(yǎng)且不易受病毒感染的特性。HEK293 細(xì)胞則以 "生長快、轉(zhuǎn)染效率高" 著稱，在懸浮無血清培養(yǎng)中表現(xiàn)優(yōu)異，常被用于藥物發(fā)現(xiàn)和毒性測試。

       哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)分為兩類：穩(wěn)定基因表達(dá)（SGE）和瞬時基因表達(dá)（TGE）。SGE 需要篩選穩(wěn)定整合目的基因的細(xì)胞株，周期長達(dá)數(shù)月；而 TGE 無需復(fù)雜篩選，直接將目的基因（GOI）導(dǎo)入細(xì)胞，2-4 周就能實(shí)現(xiàn)從基因克隆到蛋白表達(dá)（產(chǎn)量從毫克到克級），尤其適合早期研發(fā)和快速驗(yàn)證（圖 1）。不過，TGE 的產(chǎn)量目前仍低于 SGE，如何突破這一瓶頸，正是本文要探討的核心。

       二、瞬時基因表達(dá)（TGE）系統(tǒng)的核心組成

       TGE 系統(tǒng)的高效運(yùn)行，依賴于 "細(xì)胞系、表達(dá)載體、培養(yǎng)基" 三大核心要素的協(xié)同作用。

       （一）細(xì)胞系：生產(chǎn)蛋白的 "種子"

       目前 TGE 系統(tǒng)中最常用的是 CHO 和 HEK293 細(xì)胞，它們各自衍生出多個亞型，適配不同的生產(chǎn)需求：

       CHO 細(xì)胞：源自中國倉鼠卵巢組織，已開發(fā)出 CHO-S、CHO DG44、GS 敲除 CHO 等亞型。其中 CHO-S 生長快速，適合懸浮培養(yǎng)；GS 敲除型通過谷氨酰胺合成酶篩選，能穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白。

       HEK293 細(xì)胞：源自人胚腎細(xì)胞，亞型包括 293E、293T、293F 等。293F 在無血清懸浮培養(yǎng)中可達(dá)到高細(xì)胞密度，轉(zhuǎn)染效率高，是 TGE 的 "?？?quot;。

       不過，HEK293 細(xì)胞也有局限：生產(chǎn)的蛋白糖基化結(jié)構(gòu)與人類細(xì)胞存在差異，且易受人類病毒污染，限制了其臨床應(yīng)用。

       （二）表達(dá)載體：攜帶目的基因的 "運(yùn)輸車"

       表達(dá)載體是攜帶目的基因進(jìn)入細(xì)胞的 "工具"，其核心是調(diào)控元件，包括啟動子、增強(qiáng)子、終止子等，直接影響蛋白表達(dá)效率。例如：

       啟動子：像 "開關(guān)" 一樣啟動基因轉(zhuǎn)錄，人類巨細(xì)胞病毒（hCMV）啟動子是常用的 "強(qiáng)開關(guān)"，能高效驅(qū)動抗體等蛋白的表達(dá)。

       輔助蛋白元件：若載體攜帶 EB 病毒核抗原 1（EBNA-1）或大 T 抗原基因，可幫助目的基因在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，提升 TGE 效率。

       （三）培養(yǎng)基：細(xì)胞生長的 "營養(yǎng)餐"

       培養(yǎng)基為細(xì)胞提供營養(yǎng)，其成分直接影響細(xì)胞活力和蛋白產(chǎn)量。早期培養(yǎng)基需添加 10%-20% 血清，但血清成分復(fù)雜、易污染，給下游純化帶來麻煩。如今，無血清培養(yǎng)基（SFM）成為主流：它用明確成分的血清替代物組成，不僅消除了血清干擾，還降低了生產(chǎn)成本，是規(guī)?；a(chǎn)的 "標(biāo)配"。

       三、TGE 系統(tǒng)的優(yōu)化策略：從細(xì)節(jié)突破產(chǎn)量瓶頸

       要提升 TGE 的效率，需從細(xì)胞、載體、培養(yǎng)條件等多維度優(yōu)化。以下是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的關(guān)鍵策略（圖 2）。

       （一）細(xì)胞系改造：讓 "細(xì)胞工廠" 更高效

       通過基因編輯或工程化改造細(xì)胞，可增強(qiáng)其抗凋亡能力、提升蛋白合成效率。

       敲除凋亡基因：細(xì)胞在培養(yǎng)中會因壓力凋亡，影響蛋白產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)，敲除 CHO-K1 細(xì)胞的凋亡基因 Bax 和 Bak 后，抗體滴度提升了 3-4 倍；過表達(dá)抗凋亡基因 Bcl-xL，CHO-DG44 細(xì)胞的融合蛋白產(chǎn)量增加 70%-270%，且細(xì)胞活力能維持在 90% 以上。

       增強(qiáng)蛋白折疊能力：蛋白在細(xì)胞內(nèi)折疊錯誤會導(dǎo)致產(chǎn)量下降。若讓 CHO 細(xì)胞過表達(dá)未折疊蛋白反應(yīng)因子（如 XBP-1S）或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶（ERO1-La），可幫助蛋白正確折疊，抗體產(chǎn)量能提升 5.3-6.2 倍。

       亞型篩選：ExpiCHO-S?和 Expi293F 等工程化亞型表現(xiàn)突出。Expi293F 在懸浮培養(yǎng)中能達(dá)到高細(xì)胞密度，轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)量比普通 293 細(xì)胞高 3-4 倍，尤其適合需要復(fù)雜修飾的蛋白生產(chǎn)。

       （二）表達(dá)載體工程：讓 "運(yùn)輸車" 更能裝

       優(yōu)化載體的調(diào)控元件，可顯著提升目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。

       啟動子優(yōu)化：雙啟動子載體（如同時攜帶兩個 hCMV 啟動子）比傳統(tǒng)單啟動子或雙順反子載體更高效，在 CHO 細(xì)胞中抗體產(chǎn)量提升 1.4-1.9 倍。此外，cumate 基因開關(guān)啟動子（CR5）的效率是 hCMV 啟動子的 3-4 倍，堪稱 "超強(qiáng)開關(guān)"。

       順式作用元件：這些元件像 "助推器" 一樣增強(qiáng)基因表達(dá)。例如，泛染色質(zhì)開放元件（UCOE）能防止基因被沉默，使抗體產(chǎn)量提升 1.5 倍；將 WPRE（ woodchuck 肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件）與內(nèi)含子 A 等元件組合，可使蛋白表達(dá)量提升 10.5 倍。

       信號肽優(yōu)化：信號肽負(fù)責(zé)引導(dǎo)蛋白分泌到細(xì)胞外，選對信號肽能提升分泌效率。人類白蛋白和天青殺素來源的信號肽表現(xiàn)最佳，在 CHO 細(xì)胞中可使蛋白產(chǎn)量提升 1.5-2 倍；甚至可通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì) "定制信號肽"，例如針對難表達(dá)的單抗，定制信號肽能使產(chǎn)量提升 2.5 倍。

       （三）培養(yǎng)基與培養(yǎng)工藝：為細(xì)胞 "量身定制" 生長環(huán)境

       培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的細(xì)微調(diào)整，能大幅提升細(xì)胞活力和蛋白產(chǎn)量。

       培養(yǎng)基添加物：

•        蛋白胨（含肽和氨基酸）是 "營養(yǎng)強(qiáng)化劑"，在 CHO-DG44 細(xì)胞中添加后，TGE 產(chǎn)量提升 37%；小麥蛋白胨可使細(xì)胞生長增加 30%，干擾素 -γ 產(chǎn)量提升 60%。

•        二甲基亞砜（DMSO）和醋酸鋰（LiAc）能幫助蛋白折疊，減少聚集。在 CHO 細(xì)胞中添加后，抗體產(chǎn)量可達(dá) 80mg/L；HEK293 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后 4 小時添加 10% DMSO，蛋白表達(dá)量提升 1.6 倍，且無明顯毒性。

       培養(yǎng)工藝優(yōu)化：

•        溫和低溫培養(yǎng)：細(xì)胞在 37℃快速生長后，轉(zhuǎn)至 32-33℃培養(yǎng)，可使蛋白產(chǎn)量提升 1.5-6.2 倍。這是因?yàn)榈蜏啬茏尲?xì)胞停留在 G1/G0 期，減少分裂能耗，專注于蛋白合成，同時還能增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力。

•        光照調(diào)控：通過 CRISPR-dCas9 光控系統(tǒng)（LACE），可在光照下激活基因表達(dá)，使 eGFP（綠色熒光蛋白）的 TGE 產(chǎn)量提升 4 倍，實(shí)現(xiàn) "按需生產(chǎn)"。

       （四）轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化：讓目的基因 "精準(zhǔn)進(jìn)入" 細(xì)胞

       轉(zhuǎn)染是將目的基因?qū)爰?xì)胞的關(guān)鍵步驟，優(yōu)化試劑、比例和操作能提升效率。

       轉(zhuǎn)染試劑選擇：聚乙烯亞胺（PEI）是常用試劑，25kDa 線性 PEI 能使 CHO 細(xì)胞的抗體產(chǎn)量提升 2 倍；超支化聚賴氨酸（HBPL）無需預(yù)孵育，在含血清培養(yǎng)基中也能高效轉(zhuǎn)染，產(chǎn)量媲美甚至超過 PEI。

       試劑比例：PEI 與 DNA 的比例（w/w）為 3:1 時，轉(zhuǎn)染效率最高（60%-66.93%）；在 Bax/Bak 雙敲除 CHO 細(xì)胞中，當(dāng)比例為 5:1 時，抗體產(chǎn)量提升 3-4 倍。

       輔助方法：電穿孔結(jié)合抑制劑處理（如丁酸鈉），可使 CHO 細(xì)胞的熒光強(qiáng)度提升 4.8 倍；質(zhì)粒 DNA 經(jīng) 72℃加熱 30 分鐘，能提升 HEK293T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，可能與去除雜質(zhì)有關(guān)。

       （五）輔助基因共表達(dá)：為蛋白生產(chǎn) "搭把手"

       共表達(dá)某些輔助基因，可增強(qiáng)細(xì)胞活力、促進(jìn)目的基因表達(dá)或蛋白折疊。

       抗凋亡與增殖基因：共表達(dá) Bcl-xL 能減少細(xì)胞凋亡，使 CHO 細(xì)胞的蛋白產(chǎn)量提升約 2 倍；EBNA-1 與多瘤病毒大 T 抗原（PyLT）共表達(dá)，可使 CHO 細(xì)胞的特異性生產(chǎn)力（qP）提升 22.9 倍，因?yàn)樗鼈兡軒椭康幕蛟诩?xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在。

       microRNA（miRNA）調(diào)控：miR-17 和 miR-92a 能促進(jìn) CHO 細(xì)胞生長，使蛋白產(chǎn)量提升 3 倍；抑制 miR-7 則能減少細(xì)胞凋亡，讓分泌型堿性磷酸酶（SEAP）的產(chǎn)量翻倍。

       蛋白折疊輔助因子：共表達(dá)親環(huán)蛋白 B（CypB）與 SP35Fc 融合蛋白（比例 5:1），可消除蛋白聚集，使產(chǎn)量提升 6 倍，且產(chǎn)物更純凈。

       四、優(yōu)化效果匯總：數(shù)據(jù)見證突破

       不同優(yōu)化策略的效果可通過細(xì)胞密度、產(chǎn)量和特異性生產(chǎn)力（qP）直觀體現(xiàn)（表 1）。例如，細(xì)胞系改造中，ExpiCHO-S?能使產(chǎn)量提升 2.5-6 倍；載體工程中，CR5 啟動子的效率是 hCMV 的 3-4 倍；培養(yǎng)基優(yōu)化中，小麥蛋白胨使 CHO-K1 細(xì)胞的產(chǎn)量提升 1.6 倍；輔助基因共表達(dá)中，EBNA-1 與 NDPK-A 組合能使產(chǎn)量提升 1.75-2.5 倍。這些數(shù)據(jù)證明，多策略聯(lián)合使用（如細(xì)胞改造 + 低溫培養(yǎng) + 輔助基因共表達(dá)）能實(shí)現(xiàn) "1+1>2" 的效果。

       五、總結(jié)與展望

       TGE 系統(tǒng)憑借短周期、易操作的優(yōu)勢，已成為生物藥早期研發(fā)的核心工具。通過細(xì)胞系改造、載體工程、培養(yǎng)基優(yōu)化等策略，其蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量已大幅提升，但仍面臨批間差異、規(guī)?；a(chǎn)效率不足等挑戰(zhàn)。

       未來，結(jié)合組學(xué)技術(shù)（基因組、轉(zhuǎn)錄組）和人工智能數(shù)據(jù)分析，有望精準(zhǔn)找到影響 TGE 的關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)出 "量身定制" 的優(yōu)化方案。例如，通過 AI 預(yù)測最佳培養(yǎng)基成分或轉(zhuǎn)染條件，進(jìn)一步縮短研發(fā)周期、降低成本?？梢灶A(yù)見，隨著技術(shù)的突破，TGE 系統(tǒng)將在生物制藥產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮更大作用，加速更多創(chuàng)新藥從實(shí)驗(yàn)室走向臨床。