益生菌對人體健康發(fā)揮諸多積極作用，但由于益生菌在加工貯藏和消化過(guò)程中會(huì )發(fā)生活性損失，直接口服益生菌很難達到預期的益生效果。因此，需要將益生菌封裝到具有保護和靶向遞送作用的載體中，提高 益生菌對外界和消化道內極端環(huán)境的耐受性。目前用于實(shí)現益生菌腸道靶向輸送的口服遞送系統包括微膠囊、水凝膠、油凝膠、納米涂層、乳液、納米纖維、孢子、生物膜等。

       1、微膠囊

       微膠囊是由食品大分子通過(guò)噴霧干燥法制備的具有核殼結構的保護載體，可以將益生菌和外界環(huán)境隔絕，實(shí)現益生菌的控制釋放。制備微膠囊的常用壁材包括海藻酸鹽、殼聚糖、明膠和果膠等。幾乎所有的益生菌微膠囊化技術(shù)都包含干燥過(guò)程，常采用噴霧干燥、冷凍干燥、電噴霧、乳化等方法制備益生菌微膠囊。噴霧干燥是一種快速且相對便宜的制備微膠囊的方法，轉谷氨酰胺酶可以通過(guò)形成二硫鍵增強蛋白質(zhì)機械強度，從而在噴霧干燥過(guò)程中保護益生菌免受高溫損傷。乳清分離蛋白也可以在噴霧干燥過(guò)程中起到保護益生菌的作用，研究發(fā)現乳清分離蛋白可以與鼠李糖乳桿菌菌毛上的蛋白質(zhì)特異性結合，在菌體表面形成蛋白質(zhì)層，提高 益生菌耐熱性和抗氧化性。

       2、水凝膠

       水凝膠是由親水食品大分子通過(guò)物理或化學(xué)交聯(lián)而形成的具有吸水膨脹性的三維網(wǎng)絡(luò )結構，廣泛應用于益生菌/功能因子遞送、藥物遞送、3D細胞培養支架和組織工程等領(lǐng)域。益生菌可以封裝在水凝膠微球的內部或接種在微球表面。海藻酸鹽是最常用的水凝膠封裝材料之一，它可以與Ca2＋結合，形成水凝膠交聯(lián)網(wǎng)絡(luò )結構。通過(guò)海藻酸鹽、果膠和明膠的生物復合水凝膠封裝植物乳桿菌，可以顯著(zhù)提高植物乳桿菌的胃酸耐受性，孵育6 h后，模擬胃液中的植物乳桿菌存活率比游離植物乳桿菌高26%，并且貯藏4 周后，包埋的益生菌具有更高的氧化穩定性。不過(guò)，傳統的合成水凝膠在被稀釋后機械強度會(huì )降低，表現出溶脹弱化的現象，不利于益生菌封裝系統的穩定。有研究開(kāi)發(fā)了一種溶脹強化水凝膠，將脂質(zhì)體膜納米屏障共嵌入水凝膠網(wǎng)絡(luò )結構中，溶脹過(guò)程中水凝膠網(wǎng)絡(luò )結構拉伸，導致脂質(zhì)體膜納米屏障變形，封裝物質(zhì)跨膜擴散，形成新的網(wǎng)絡(luò )，這種雙網(wǎng)絡(luò )結構增強了機械強度。

       微米尺度的水凝膠稱(chēng)為微凝膠。用于制造微凝膠的材料通常是生物聚合物，例如淀粉、海藻酸鹽、角叉菜膠等，它們是具有多孔聚合物分子網(wǎng)絡(luò )的生物聚合物顆粒，多數是全天然無(wú)毒材料，可以保護封裝的益生菌不受損傷。益生菌需要在胃中穩定，在腸道釋放，并且需要在腸黏液層定植才能發(fā)揮生理作用。腸黏液層是由富含半胱氨酸巰基的糖蛋白構成的疏水凝膠網(wǎng)絡(luò )。為了同時(shí)解決益生菌時(shí)空釋放和黏附定植的問(wèn)題，有研究人員使用半胱氨酸修飾氧化魔芋多糖，獲得了同時(shí)具有巰基和羧基的巰基化氧化魔芋多糖，和鐵離子可以形成二硫鍵-S-S-和-COO-Fe3＋-COO-共存的雙交聯(lián)水凝膠，該水凝膠在胃環(huán)境中穩定，能夠保護益生菌不受胃酸脅迫，在腸pH值下響應性釋放益生菌，釋放后益生菌表面纏結的巰基化魔芋多糖作為橋梁和富含巰基的黏蛋白發(fā)生巰基化交換反應并生成新的二硫鍵，將益生菌牢固地黏附在黏液層上，有效提高了雙歧桿菌的腸道活菌數和菌群豐度，使益生元魔芋多糖和益生菌協(xié)同調控腸道菌群平衡，發(fā)揮益生作用。

       3、油凝膠

       油凝膠是液態(tài)油通過(guò)添加凝膠劑，自組裝為網(wǎng)絡(luò )結構或液態(tài)油結晶，進(jìn)而形成包含非極性液相的黏彈性三維網(wǎng)絡(luò )結構材料。常用的凝膠劑有甘油單酯、卵磷脂、蠟等。油凝膠具有疏水性和乳化性，相較于水凝膠，其物理屏障可以更好地隔離水分，提高 益生菌存活率。例如，基于大豆卵磷脂的油凝膠可以提高嗜酸乳桿菌和乳酸雙歧桿菌的存活率。此外，油凝膠只能被腸道中的脂肪酶消化，實(shí)現益生菌的腸道靶向遞送。常采用油凝膠與水凝膠結合形成的雙凝膠，其同時(shí)具有親脂性和親水性雙重特性，可以進(jìn)一步提高 益生菌的存活率。研究報道，采用大豆卵磷脂-硬脂酸油凝膠乳液和乳清蛋白水凝膠混合包封嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌，3周和5周后在酸奶中的活菌數明顯高于游離菌，并且與純油凝膠相比，混合凝膠中的乳清蛋白可以使乳雙歧桿菌的活菌數提高5.2（lg（CFU/mL））。

       4、納米涂層

       納米涂層是一種包封單個(gè)益生菌的方法，因其制備簡(jiǎn)單，已成為益生菌納米包封領(lǐng)域的焦點(diǎn)。可以通過(guò)氫鍵、 π-π堆積、邁克爾加成反應和席夫堿反應形成聚多巴胺納米涂層，封裝單個(gè)活細胞，顯著(zhù)提高 益生菌的生物利用率。例如有研究人員采用藥用蠶絲蛋白自組裝在大腸桿菌Nissle 1917（EcN）表面形成納米涂層，體外實(shí)驗發(fā)現封裝后的EcN在模擬胃液中的存活率提高52 倍，腸道定植能力提高5.8倍，同時(shí)藥用蠶絲蛋白天然的抗炎功能進(jìn)一步提升了EcN的腸炎治療能力，起到協(xié)同治療的效果。此外，層層組裝技術(shù)（layer-by-layer，LbL）是制備多層涂層材料的常用方法，已經(jīng)被應用于益生菌遞送載體。

       5、乳液

       目前用于封裝益生菌的乳液包括水包油（O/W）乳液、油包水（W/O）乳液、水包水（W/W）乳液和混合型（O/W/O或W/O/W）乳液。采用乳液作為口服遞送系統操作簡(jiǎn)單，適于大規模生產(chǎn)；對熱穩定，可使益生菌產(chǎn)品保存較長(cháng)時(shí)間。納米乳液通常是透明的，因為乳液液滴非常小，不會(huì )強烈散射光波，所以非常適用于生產(chǎn)透明的食品。其中，皮克林乳液的凝膠結構穩定，可以減少益生菌與胃腸道產(chǎn)物（胃酸、膽鹽等）的接觸，大大提高 益生菌在口服遞送中的穩定性。研究表明，在采用乳液封裝益生菌的過(guò)程中，益生菌可以在高負載力下封裝進(jìn)含果膠的O/W高內相皮克林乳液中，65 ℃、30 min后未封裝的乳雙歧桿菌幾乎全部死亡，而封裝的益生菌活菌數為5.31（lg（CFU/mL））。

       6、納米纖維

       納米纖維具有高比表面積，易通過(guò)高壓均質(zhì)、酶水解、超聲處理等技術(shù)改性，非常適于益生菌的口服遞送。高壓電場(chǎng)靜電紡絲技術(shù)生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)條件溫和，可以快速獲得直徑小、比表面積大、透氣率高的纖維材料，適于封裝對溫度敏感的益生菌，是納米纖維封裝益生菌的常用方法。研究表明，采用靜電紡絲技術(shù)制備的阿拉伯膠和普魯蘭多糖雜化納米纖維包封乳酸菌，具有較高封裝穩定性，封裝后的乳酸桿菌存活率達到85.4%～97.8%，而冷凍干燥后的存活率為80.9%～89.8%，此外采用靜電紡絲技術(shù)制備的封裝乳酸菌具有更好的貯藏穩定性，4 ℃貯藏28 d后，存活率仍在70%以上。

       7、孢子

       孢子是細菌的休眠形式，具有多層疏水蛋白質(zhì)外殼，可以保護細菌免受胃酸侵害，并且在腸道中發(fā)芽釋放，非常適合于益生菌的口服遞送。孢子在益生菌遞送中的應用分為兩種，一種是將益生菌轉化為孢子形式封裝，但天然孢子具有難以控制體內發(fā)芽效率的缺點(diǎn)，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出人工孢子：通過(guò)β-環(huán)糊精和金剛烷介導的主客體相互作用，將葡聚糖包裹在丁酸梭菌孢子外形成人工孢子，該人工孢子在厭氧的腸道環(huán)境中會(huì )復活，分解葡聚糖并特異性地富集在腫瘤組織周?chē)a(chǎn)生抗癌短鏈脂肪酸，抑制腫瘤生長(cháng)。另一種是提取孢子殼中的有效成分并用其封裝益生菌，孢子殼納米材料具有極強的極端環(huán)境（強酸、強堿、模擬胃腸液）耐受性，并且可以降低腸道ROS水平，極大程度抵抗惡劣環(huán)境，保護益生菌。

       8、生物膜

       生物膜可以提高 益生菌的附著(zhù)能力，隔絕抗生素等外界環(huán)境的侵擾。通過(guò)枯草芽孢桿菌分泌的胞外多糖和蛋白質(zhì)形成固體生物膜封裝枯草芽孢桿菌，可顯著(zhù)提高枯草芽孢桿菌的胃腸道耐受性、生物利用度和腸道定植能力。研究報道在磷酸鈣緩沖溶液中通過(guò)二油酰磷脂酸和膽固醇制備脂質(zhì)膜封裝EcN，封裝后的EcN顯示出極高的強酸、強堿、模擬胃腸液、抗生素和乙醇抗性，胃部存活率比未包封的EcN高出近3 倍。

       遞送手段的評價(jià)方式

       優(yōu)質(zhì)的靶向益生菌遞送系統是能夠在胃和小腸等特殊生理環(huán)境中維持益生菌的完整性和活性，并在結腸等部位靶向釋放益生菌。目前主要通過(guò)各種體外或體內釋放效率評估實(shí)驗來(lái)評估靶向益生菌遞送系統的優(yōu)劣。

       1、溶出度實(shí)驗

       溶出度指活性益生菌、藥物等從片劑、膠囊劑或顆粒劑等制劑在規定條件下溶出速率和溶出程度。溶出度測試是評估靶向益生菌遞送系統使用最廣泛的方法之一，具有重復性好、精準度高等特點(diǎn)。最新的Vision 溶出度儀系列可使用轉籃法、槳法、槳-碟法、轉筒法、小杯法、大杯法等來(lái)評估不同聚合物材料制備的靶向益生菌遞送系統。目前常用動(dòng)力學(xué)模型包括零階模型、一階模型、Higuchi 模型、Ritger-Peppas模型和 Weibull 模型來(lái)研究負載在不同靶向載體中生物活性物質(zhì)的釋放機理。

       體外溶出度實(shí)驗過(guò)程中，常采用不同 pH 值的緩沖液來(lái)模擬胃腸液，然而該實(shí)驗無(wú)法精準反映靶向益生菌遞送系統在人類(lèi)胃腸道的真正釋放性能。近年來(lái)，相關(guān)學(xué)者添加胃蛋白酶、胰蛋白酶、和 β-葡萄糖苷酶等至模擬胃腸液中，或添加動(dòng)物盲腸內容物或人類(lèi)糞便至釋放介質(zhì)中進(jìn)行遞送系統體外釋放研究，研究發(fā)現改良后釋放介質(zhì)中的包埋成分體外釋放率顯著(zhù)升高。但是，胃腸道非常復雜，即使存在相關(guān)的酶，模擬培養基也無(wú)法準確代表體內胃腸道的真實(shí)環(huán)境，因此選擇合適的培養基以準確評估靶向載體中益生菌的釋放曲線(xiàn)至關(guān)重要。

       2、細胞實(shí)驗

       細胞體外模型實(shí)驗也是評價(jià)益生菌遞送系統的重要手段，如評估益生菌遞送系統及釋放的益生菌對正常細胞或癌細胞等的殺傷性能、免疫性能。也可通過(guò)構建細胞模型，評價(jià)聚合物載體保護益生菌或藥物等活性物質(zhì)在胃腸道被物理化學(xué)作用破壞的情況、細胞攝取方式的變化以及對胃腸道上皮緊密連接的作用等。如利用 Caco-2 細胞模型研究載體材料的毒性和及其被細胞吸收、外排機制，建立 MDCK 細胞單層跨膜轉運模型，綜合分析遞送系統在細胞表面的吸附，被細胞內吞及跨膜轉運機制。

       3、成像實(shí)驗

       活體成像、熒光成像等成像技術(shù)為評價(jià)藥物遞送系統提供了一種高效、實(shí)時(shí)、直觀(guān)的新方法，可評估所遞送的生物活性物質(zhì)的部位特異性、生理功效以及其釋放行為。例如，利用多光譜熒光成像可以有效實(shí)現藥物載體材料、負載藥物、腫瘤細胞等的實(shí)時(shí)成像及監控，并可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)揭示藥物釋放與疾病治療效果的相關(guān)性，為更高效的藥物遞送系統設計提供研究基礎。基于光學(xué)成像技術(shù)的益生菌體內示蹤技術(shù)也可通過(guò)同一組實(shí)驗動(dòng)物對象在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄檢測，示蹤封裝的益生菌在體內胃腸道的變化，避免了體外實(shí)驗的繁瑣，效率高且無(wú)創(chuàng )傷性。有研究通過(guò)X射線(xiàn)成像技術(shù)評價(jià)結腸靶向遞送系統在胃腸道的耐受性及崩解率，證實(shí)了該成像技術(shù)監測結腸靶向微球變化的可行性。此外，還有相關(guān)研究使用熒光圖像分析儀監測標記有 FITC 的微膠囊或藻酸鹽-殼聚糖微球在體內的靶向遞送軌跡。

       4、離體實(shí)驗

       益生菌具有抑菌、抗炎、調節微生態(tài)平衡、分泌細菌素等多種功能。為了保護益生菌的活性及生物利用度，相關(guān)學(xué)者利用離體實(shí)驗對靶向益生菌遞送系統進(jìn)行了大量研究，主要集中在利用組織切片、胃腸道離體組織培養等技術(shù)評估靶向益生菌遞送系統的粘膜黏附特性及其負載的益生菌生物活性物質(zhì)對腸道等患病器官的影響等方面。如通過(guò)測定果膠和聚合體材料（聚乙烯吡咯烷酮）的離體黏膜黏附強度來(lái)研究其粘膜黏附特性。有研究利用三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的大鼠結腸炎評估"殼聚糖-Ca-藻酸鹽"遞送系統裝載的"干酪乳桿菌01+低聚果糖+菊粉"合生素的抗炎活性。病理切片結果表明裝載在遞送系統中的合生素在改善結腸粘膜炎性浸潤、緩解結腸炎疾病方面顯示出更好的療效，MPO 活性值降低了3.5 倍，初步表明遞送系統顯著(zhù)改善干酪乳桿菌 01 的細胞的活力及其生物利用度。此外，通過(guò)離體胃腸道（胃、十二指腸、空腸、回腸和結腸）組織培養技術(shù)也表明基于乳清蛋白分離物 WPI的微膠囊對 FITC 標記的發(fā)酵乳桿菌 39-183 具有出色的保護作用，最大限度的弱化了胃酸的殺菌作用，并使到達回腸、結腸中益生菌的數量達到最大化。

       參考資料

       [1]朱荻,陳莎男,梅曉宏,等.提高 益生菌耐加工貯藏穩定性和體內存活率的遞送系統研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2023,44(21):1-13.

       [2]賈國超,陳曉鳳,張軍,等.基于聚合物載體的益生菌遞送系統：載體類(lèi)型、性能評價(jià)及新技術(shù)應用[J].現代食品科技,2022,38(07):338-344.

       作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現就職于國內某大型藥物研發(fā)公司，從事?tīng)I養食品的開(kāi)發(fā)與研究。